嗅觉受体基因和蛋白的研究进展

彭 鹤，赵鲁杭 综述

(浙江大学医学院生物化学与分子生物学实验室，浙江杭州310058)

嗅觉在动物的生命活动中起着重要作用，是生物体感受外界环境的一种生理感觉。生物嗅觉系统可以识别环境中成千上万种不同的气味分子，以获得对外界环境的直观感觉联系。许多动物依赖嗅觉来完成交配、取食、避开天敌、识别有毒物质以及群体交流等。

1991年Buck和Axel首次在小鼠体内克隆了嗅觉受体(olfactory receptors，ORs)基因并发现了嗅觉受体基因超家族［1］，证明了啮齿类动物大约有1 000种不同类型的嗅觉受体基因。随后，他们又对嗅觉信号在脑内的传递、修饰和加工进行了深入研究，阐明了嗅觉受体属于7次跨膜的G-蛋白偶联受体家族，在气味识别过程中起着重要的作用。嗅觉感知起始于嗅觉受体蛋白与气味分子的结合，配体受体结合物活化细胞内的G-蛋白，活化的G-蛋白激活腺苷酸环化酶，使细胞内大量的ATP转化成cAMP。cAMP是细胞内第二信使，可使细胞膜上的核苷酸门控离子通道打开，引起细胞外钙离子等阳离子内流，细胞产生动作电位。由此，将气味分子的化学信号转化成电信号，通过轴突传到更高级的脑部结构，实现嗅觉的感知。这些研究让人们对嗅觉的认识产生了飞跃，Buck和Axel也因此获得了2004年诺贝尔生理学或医学奖。

1 OR基因研究

1.1 OR基因和假基因化 OR是由嗅觉细胞表达的一种蛋白质，能够与气味分子结合。而OR基因属于数量庞大的多基因超家族，在哺乳动物中仅次于免疫系统编码基因。随着各物种基因组计划的展开，一些物种基因组序列的测序完成，发现人类有851个OR基因，并成簇地分布在染色体上(除了20号和 Y染色体)［2］;鼠类大约有 1296 个，也成簇地分布在鼠染色体中(除了12号和Y染色体)［3-4］。犬的OR基因库含有971个OR基因，而鸡的则由554个OR基因组成［5］。相比较而言，鱼类的OR基因数目少，仅约100个OR基因。

研究证明，OR基因在进化过程中出现了不同程度的假基因化。所谓假基因化(pseudogene)是指基因中含有一个或多个破坏框架(包括移码，片段终止密码，或片段破坏散布重复等)［6］。Idan等就189个人种中51个OR基因进行了研究，发现功能基因在这些人种中假基因化有扩大的趋势，还发现OR基因在人类基因组中功能种群的多样性，也就是个体之间的差异，揭示了不同的人嗅觉灵敏度不同［7］。人类OR基因中约50%的基因为假基因，只有384个完整的具有潜在功能的基因［8］，鼠OR基因也有约20%的假基因化，真正具有功能的OR基因约为1 200个，是人类的3倍多。这可能与鼠的生存对嗅觉依赖度远大于人类有关。

1.2 OR基因结构及表达调控 OR是由多基因超家族编码，每个嗅觉受体基因由约1 kb长的编码区域组成，且编码区域内没有内含子，编码区下游是多聚腺苷酸信号约0.15～1.5 kb长。OR基因的5＇端有数目可变的非编码外显子，从非编码外显子到编码外显子总长在1～11 kb之间，这些非编码外显子在转录过程中是可以选择性断裂拼接，产生不同类型的ORmRNA，但是最终编码的嗅觉受体蛋白结构却相同［9］。有研究表明，嗅觉受体基因主要是在嗅觉感觉神经元表面表达，与其它G-蛋白偶联受体比较，非编码外显子选择性拼接可能调节了OR表达的组织特异性。

嗅觉感觉神经元表达嗅觉受体有着严格的规范，1个嗅觉感觉神经元只表达OR基因库中的1个OR基因，即One Neuron-One Receptor原则。而且每种生物的嗅觉表达都遵循这种原则［10］。OR基因这种严格表达的形式，一直让人费解。这其中的核心调节机制目前尚不清楚，1个嗅觉感觉神经元只表达等位基因中的1个，这种等位基因排斥是如何在嗅觉系统中完成的也不明确。为了探索这其中的机理，研究者选择基因调控的几个重要位点，如启动子序列、增强子和转录起始结合位点等作为研究的入手点。Sakano研究小组通过生物信息学发现，在小鼠MOR28基因簇的上游有一个长2 kb的DNA区域，称为“H区域”(H源于小鼠基因与人类基因的高度同源)，这个区域在啮齿动物和人类的OR基因序列中都是保守序列，可能作为一个顺式作用基因座控制区(locus control region，LCR)，调控 OR表达。实验证明，H区域与MOR28下游OR基因相互作用，激活 OR基因库中单个 OR基因的表达［11］。Michaloski等在一些OR基因的启动子序列中发现了1个高度保守区域O/E-like位点，对OR基因表达调控可能有增强作用［12］。Serizawa等人则用遗传学方法对小鼠的嗅觉感觉神经元进行研究，发现单个OR基因选择性表达的这种少见，随机的转录激活形式是由负反馈抑制机制调控［13］，当1个OR基因在嗅觉神经元中表达蛋白后，这个蛋白通过反馈作用抑制嗅觉神经元内其它OR基因的表达。近年，Tobar研究小组利用生物信息学方法，在人类OR基因的5＇端的非编码区发现1个高度保守的区域(highly conserved regions，HCR)。这个HCR位于转录起始位点(transcription start sites，TSS)上游，在功能基因和假基因中都存在，Tobar等采用T-Coffee工具对多个OR的转录结合位点进行多重序列对齐分析，发现不同的HCR基因有不同的TATA-box和转录结合位点，这提示HCR在不同位置表现的转录作用不同，对OR基因转录调控可能有增强功能［14］。

1.3 OR的分类及进化 目前已知的OR基因分为Ⅰ型和Ⅱ型OR两类。在研究非洲爪蟾等两栖动物时发现，Ⅰ型OR能特异性检测水溶性气味，而Ⅱ型OR能识别挥发性气味。在哺乳动物中，Ⅰ型OR只占10%，而Ⅱ型OR明显占大多数。在鱼类中，所有OR基因都属于Ⅰ型［15］。研究发现，在多数物种中大部分Ⅱ型OR是假基因，如水生哺乳动物条纹海豚有大量的Ⅱ型受体基因，这些基因都已证明是没有功能的假基因［16］，这可能与条纹海豚的生存环境相关。

比较基因组学研究显示，哺乳动物的嗅觉灵敏度与功能性OR基因在基因组中所占比例呈正相关，同时在物种进化过程中，功能性OR所占比例与该物种对嗅觉的依赖性相关，与进化论中的“用进废退”原则一致。研究证明，有很大部分的OR基因退化为假基因，鼠的嗅觉受体基因大约有20%假基因化［3］，而人类基因家族含有更多(＞50%)［2］。这标志着鼠有更大的选择压力来保持1个大的嗅觉受体的功能。研究显示，嗅觉受体基因在人类和灵长类物种中假基因化呈流行趋势，造成这个趋势的主要原因可能是基因漂流，一种基因随机复制和缺失的过程［17-18］。这种过程也导致了OR基因在不同物种中的进化差异，最后才有嗅觉功能的千差万别。

2 OR蛋白研究

2.1 OR蛋白的结构 嗅觉受体蛋白是行使嗅觉功能的主要蛋白，它的发现不仅在阐明嗅觉系统的组织和功能中起着不可替代的作用，同时为生物体中的其它化学感受器的研究提供了模板［19］。嗅觉受体蛋白为G蛋白偶联受体，约含300～350个氨基酸，缺乏N-末端信号肽序列。序列分析显示它们与7次跨膜的G-蛋白偶联受体含有共同的结构特征，如7个疏水性的α-螺旋跨膜结构(每个大约有19-26个氨基酸)，蛋白的N-末端位于细胞外侧，C-末端位于细胞内侧(图1)［1］。除此之外，嗅觉受体蛋白还有一些特征性的结构:高度同源的细胞外1环和2环的半胱氨酸之间形成1个二硫键(图1)，N-末端区域有1个一致保守的NXS/T序列，在细胞内有几个潜在的磷酸化位点和众多的保守短序列［20］。通过比较分析发现，不同的OR氨基酸序列具有一致的高度保守区，如膜内第1环的 LHTPMY，第3跨膜区末端和膜内第2环头端的MAYDRYVAIC，第5跨膜区末端的SY，第6跨膜区头端的FSTCSSH以及第7跨膜区的PMLNPF［21］。除了保守区域外，跨膜的3、4、5区都表现出高度的序列多样性，通过与其它的7次跨膜蛋白(如β2肾上腺素受体)结构类比，发现它们是气味分子识别和结合区域的一部分，已经在这些区域确定了17个高度可变的氨基酸残基。嗅觉受体跨膜的3、4、5区的这些可变的氨基酸残基可能与气味识别多样性相关［22］。

图1 嗅觉受体蛋白结构示意图Fig.1 Schematic representation of an olfactory receptor

2.2 嗅觉受体识别气味分子的机制 研究者［23］通过单个神经细胞的RT-PCR实验发现，每1个嗅觉神经元只表达OR基因家族中1个基因，重组嗅觉受体在嗅觉感觉神经元中表达的功能分析及给予相应配体刺激后细胞内钙成像实验发现，单个OR可以识别多种气味，1种气味也可被多个OR识别，而且不同的气味可以被不同的嗅觉受体组合所识别，这说明OR家族是通过1个组合方式来辨别气味分子的。Malnic等［24］将脂肪酸和醇类对比研究发现，气味分子在结构或是浓度上的微小变化都会导致嗅觉受体的识别变化及组合代码的变化。不同研究显示，被同一OR识别的多种气味分子在结构上有相似之处，比如含有相同的功能基团或脂肪酸的分子长度等，而识别同一气味分子的多个嗅觉受体在结构上可能有着共同的模序(图2)［24］。

图2 受体组合代码Fig.2 Combinatorial receptor code

2.3 OR蛋白异源表达 尽管人们对OR做了大量的研究，但是到目前为止，对于OR的配体确定和信号传导机制的了解有限，OR家族中只有很少的蛋白确定了其配体，而阻碍OR特征性描述的主要原因是这些受体在异源细胞中难以有效表达。

OR蛋白的7次跨膜结构和强疏水性质(膜蛋白)，同时缺少N-末端信号肽定位使得它们在异源细胞中表达时不易定位在质膜上［25］，难于提取纯化。为此，研究者针对嗅觉受体蛋白的结构特点，对其在异源系统中表达做了大量的修饰、选择，例如在嗅觉受体基因的N-端加信号肽(如rho-tag)帮助定位在细胞膜上，构建融合蛋白增加受体蛋白的可溶性，选择易于表达的异源系统如大肠杆菌、人胚胎肾细胞(HEK-293)等［26-28］。Saito 等人从单个嗅觉感觉神经元的基因表达分析中，发现了3种新颖的蛋白质，这3种蛋白质可以促进OR蛋白在异源系统的表达［29］，分别为受体运输蛋白(receptor transporting protein，RTP)1、2 和受体表达增强蛋白1(receptor expression enhancing protein 1，REEP1)。另一些研究组则证实一些热休克蛋白作为分子伴侣可以帮助OR蛋白的正确折叠［30］。尽管如此，相对于庞大的OR家族这些研究还是有限的，OR蛋白在异源系统中稳定有效的高表达还需要进一步探索。

3 展望

嗅觉系统对生物生存具有重要的作用。随着近年来人们在嗅觉方面进行的大量研究，嗅觉受体基因、结构及受体蛋白等方面取得了较大的进展，尽管如此，相对于庞大的嗅觉受体基因家族，这些研究只是冰山一角，许多问题有待解决，比如嗅觉受体基因表达调控的机制还有待进一步探索，嗅觉受体蛋白在异源系统中的表达，因其本身结构的限制，在异源系统中定位不准确，表达量少等问题，嗅觉受体的气味配体的确定等等，还待做更进一步研究。同时，近年来人们将嗅觉受体与生物传感器结合构建了仿生嗅觉传感器，有望在生物医学、疾病诊断与医药分析、环境保护等领域有广泛的应用，但这两方面的结合研究还不够全面和成熟，有待我们的探索和深入研究。尽管如此，相信随着生物技术的发展，嗅觉受体的研究会取得更多的突破，充分发掘嗅觉机能为人类创造价值。

［1］BUCK L，AXEL R.A novel multigene family may encode odorant receptors:a molecular basis for odor recognition ［J］.Cell，1991，65(1):175-187.

［2］GLUSMAN G，YANAI L，RUBIN L，et al.The complete human olfactory subgenome［J］.Genome Res，2001，11(5):685-702.

［3］GODFREY P A，MALNIC B，BUCK L B.The mouse olfactory receptor gene family ［J］.PNAS，2004，101(7):2156-2161.

［4］ZHANG X M，FIRESTEIN S.The olfactory receptor gene superfamily ofthe mouse ［J］.Nature Neuroscience，2002，5(2):124-133.

［5］NIIMURA Y.Evolutionary dynamics of olfactory receptor genes in chordates:interaction between environments and genomic contents ［J］.Hum Genomics，2009，4(2):107-118.

［6］LAI P C，BAHL G，GREMIGNI M，et al.An olfactory receptor pseudogene whose function emerged in humans:a case study in the evolution of structure-function in GPCRs ［J］.J Struct Funct Genomics，2008，9(1-4):29-40.

［7］MENASHE I，MAN O，LANCET D，et al.Different noses for different people［J］.Nat Genet，2003，34(2):143-144.

［8］FLEISCHERJ，BREER H，STROTMANM J.Mammalian olfactory receptors［J］.Frontiers in Cellular Neuroscience，2009，3(9):1-10.

［9］YOUNG J M，SHYKIND B M，LANE R P.Odorant receptor expressed sequence tags demonstrate olfactory expression of over 400 genes，extensive alternate splicing and unequal expression levels［J］.Genome Biol，2003，4(11):R711-R715.

［10］MOMBAERTS P.Odorant receptor gene choice in olfactory sensory neurons:the one receptor-one neuron hypothesis revisited ［J］.Curr Opin Neurobiol，2004，14(1):31-36.

［11］SERIZAWA S，MIYAMICHI K，and SAKANO H.Oneneuron-one receptorrule in the mouse olfactory system ［J］.Trends in Genet，2004，20(12):648-653.

［12］MICHALOSKI J S，GALANTE P A，MALNIC B.Identifcation ofpotentialregulatory motifs in odorant receptor genes by analysis of promoter sequences［J］.Genome Res，2006，16(9):1091-1098.

［13］SERIZAWA S，MIYAMICHI K，SAKANOH.Negative Feedback Regulation Ensures the One Neuron-One Receptor Rule in the Mouse Olfactory System ［J］.Chem Senses，2005，30(1):99-100.

［14］TOBAR H F，MORENO P A，VELEZ P E.Highly conserved regions in the 5＇region of human olfactory receptorgenes ［J］.Geneticsand Molecular Research，2009，8(1):117-128.

［15］ZHANG X H，FIRESTEIN S.Genomicsof Olfactory Receptors［J］.Results and Problems in Cell Differentiation，2009，47(1-12):25-36.

［16］GOTTLIEB A，OLENDER T，LANCET D，et al.Common peptidesshed lighton evolution of Olfactory Receptors ［J］.BMC Evolutionary Biology，2009，9(1):1-13.

［17］NIIMURA Y，NEI M.Evolutionary dynamics of olfactory and other chemosensory receptor genes in vertebrates［J］.J Hum Genet，2006，51(6):505-517.

［18］NEI M，NIIMURA Y，NOZAWA M.The evolution of animal chemosensory receptor gene repertoires:rolesofchanceand necessity ［J］.Nature Reviews Genetics，2008，9(12):951-963.

［19］SPEHR M，MUNGER S D.Olfactory receptors:Gprotein-coupled receptors and beyond ［J］.Journal of Neurochemistry，2009，109(6):1570-1583.

［20］MOMBAERTS P.Seven-transmembrane protein as odorant and chemosensory receptors［J］.Science，1999，286(5440):707-711.

［21］YOUNG J M，TRASK B J.The sense of smell:genomics of vertebrate odorant receptors ［J］.Hum Mol Genet，2002，11(10):1153-1160.

［22］FUCHS T，GLUSMAN G，HORN-SABAN S，et al.The human olfactory subgenome:from sequence to structure and evolution ［J］.Hum Genet，2001，108(1):1-13.

［23］DEMARIA S，NGAI J.The cell biology of smell［J］.J Cell Biol，2010，191(3):443-452.

［24］MALNIC B，HIRONO J，SATO T.Combinatorial Receptor Codes for Odors［J］.Cell，1999，96(5):713-723.

［25］BUSH C F，HALL R A.Olfactory receptor trafficking to the plasma membrane ［J］.Cellular and MolecularLife Science，2008，65(15):2289-2295.

［26］KIELY A，AUTHIER A，Kralicek A V，et al.Functional analysis of a Drosophila melanogaster olfactory receptor expressed in Sf9 cells ［J］.Journal of Neuroscience Methods，2007，159(2):189-194.

［27］SONG H S，LEE S H，OH E H，et al.Expression，Solubilization and Purification of a Human Olfactory Receptor from Escherichia coli［J］.Current Microbiology，2009，59(3):309-314.

［28］YASUOKA A，EMORI Y，ABE K.Addition of signalleadersequences to the N-terminiof olfactory receptor proteins enhances their expression in Xenopus oocyte ［J］.Biosci Biotechnol Biochem，2000，64(8):1688-1695.

［29］SAITO H，KUBOTA M，ROBERTS R W，et al.RTP familymembers induce functional expression of mammalian odorant receptors［J］.Cell，2004，119(5):679-691.

［30］BUSH C F，HALL R A.Olfactoryreceptor trafficking to the plasma membrane［J］.Cell Mol Life Sci，2008，65(15):2289-2295.