MALDI-TOF-MS 技术筛查原发性小肝细胞癌血清特异蛋白
2012-10-17何伟华独建库孙高斌高春芳
李 珂,何伟华,赵 光,独建库,孙高斌,彭 玲,高春芳
基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱(matrix assisted laser desorption/ionization-time of flightmass spectrometry,MALDI-TOF-MS)技术主要应用在蛋白质和蛋白质组学研究并直接获取某种疾病的特征性生物学标记。目前,利用MALDI-TOF-MS技术发现肿瘤的特殊生物学标记,对多种肿瘤的早期诊断研究中显示出良好的应用前景[1-6]。原发性肝癌(primary hepatocellular carcinoma,PHC)是国内外最常见的恶性肿瘤之一,肝癌在我国的发病率及病死率有逐年增高的趋势[7,8]。中晚期肝癌诊断并不困难,但临床治疗预后不佳,故肝癌早期诊断即小肝癌诊断对肝癌治疗及预后起着至关重要的作用,也一直被临床和科研工作者所关注。寻找具有高灵敏度和高特异性的原发性肝癌特异性肿瘤标志物则是原发性肝癌早期诊断的关键所在。运用MALDI-TOF-MS技术对原发性小肝癌患者与正常人血清蛋白质谱进行分析,得到高敏感性和特异性的血清蛋白,建立小肝癌诊断模型指纹图谱,为肝癌的临床治疗及预后评估提供更积极的因素。
1 资料与方法
1.1 对象及分组 选取解放军第150医院2007-09~2009-12收治的小肝癌患者35例 (均未做任何干预性治疗),影像学报告肝肿瘤直径<5 cm(以2001年中华医学会定义小肝癌标准,不严格区分微小肝癌与小肝癌),且超声引导经皮穿刺活检病理诊断报告为原发性肝癌;男23例,女12例,男女比例 1.92∶1;年龄 27~79 岁,平均 56 岁;按照 TNM 标准进行分期,Ⅰ期34例,Ⅱ期1例;按照Child-Pugh分级标准,A级30例,B级5例;甲胎蛋白(AFP)<20μg/L 者 5例, 20~200μg/L者 17例,>200μg/L者13例;有乙型肝炎、肝硬化病史29例。正常对照组共50名,为2007-09~2010-09健康体检者,男 31名,女 19名,男女比例 1.6∶1;年龄 25~83岁,平均58岁(对照组年龄与小肝癌组年龄无统计学差异);AFP正常,均无肝炎及肝硬化病史。
1.2 试剂仪器及方法
1.2.1 试剂仪器 试剂为铜螯合磁珠悬浮液、铜螯合磁珠结合缓冲液 (BS)、铜螯合磁珠清洗缓冲液(WS)、铜螯合磁珠洗脱缓冲液(ES)基质(3mg/ml CHCA,50%ACN,2%TFA)等。 仪器为 Eppendorf公司的磁珠分离器、微量加样枪、高速台式离心机、SCOUT-MTP样品靶、AUTOFLEX TOF/TOF质谱仪及Revco公司的超低温冰箱、通风橱等。
1.2.2 方法 患者空腹抽取肱静脉血2~3ml于普通干燥管中,4 ℃冰箱内静置 2 h,离心(2000 r/min,10~20min),取上清按 100μl/管分装标记,置于-70℃超低温冰箱保存。样品靶、血清样品进行结合前生化处理后,血清蛋白与标准靶进行结合:取样品10μl置于1.5ml离心管中,混匀磁珠悬浮液后取出5μl磁珠加入样品管,再加入50μl铜螯合磁珠结合缓冲液(BS),将样品管放入磁珠分离器,在前后相邻两孔间反复移动样品管10次混匀;分离后用加样枪小心吸去样品管中的溶液,向样品管中加入20μl铜螯合结合缓冲液使磁珠重新悬浮、分离;再向样品管中加入100μl铜螯合磁珠清洗缓冲液 (WS),在磁珠分离器前后相邻两孔间反复移动样品管10次混匀;向样品管中加入10μl铜螯合磁珠洗脱缓冲液(ES)混匀,磁珠与洗脱液分离,用加样枪小心将洗脱下来的多肽样品溶液移入干净的0.5ml样品管;点1μl洗脱样品及1μl基质于样品靶。
1.2.3 质谱检测 将制备好的SCOUT-MTP样品靶通过AUTOFLEX TOF/TOF质谱仪检测口放入质谱仪内部托盘并固定。启动激光系统提供脉冲激光,击打样品靶点,通过flex Control的Setup设置仪器参数,当激光开始脉冲时,数字转换器记录由检测器检测到的模拟信号,并将它们转化为数字信号。采集系统运用FlexControl软件,设定激光能量、谱图评估参数、谱图叠加次数、靶的移动方式和范围等参数。
1.2.4 统计学分析 数据统计分析系统采用FlexAnalysis和BioTools两组软件,分组调入样品数据建立模型,实验选择线性模式,再设定参数选择算法,包括快速分类法(quick classifier,QC)、遗传算法(genetic algorithm,GA)、支持向量机法(support vector machine,SVM)及监督神经网络法(supervised neural network,SNN)等,运算后显示统计分析结果并进行交叉验证。
2 结 果
2.1 蛋白质谱波峰的整合分析 软件FlexAnalysis和BioTools分析结果显示:蛋白质质荷比(M/Z)在0~100000Da范围内(共 169 个 Index),小肝癌组与正常人组有差异的蛋白质峰为55个(P<0.05,表1),两组有显著性差异的蛋白质峰为30个(P<0.01)。
2.2 分类结果 小肝癌组和正常对照组血清样品的蛋白质波谱进行比较,根据GA得到的蛋白质如表2所示,SVM得到的蛋白质如表3所示,QC得到的蛋白质如表4所示,SNN所得的蛋白质如表5所示。
2.3 交叉验证 通过交叉验证(表6)及识别能力检测 (表7)显示GA较其它三种算法结果可信度高。GA识别的M/Z值为7771.17Da的蛋白质较具有较高敏感性和特异性,可将正常人及小肝癌患者准确分开。
2.4 确定诊断模型蛋白 运用MALDI-TOF分析结果显示,M/Z值为7771.17 Da的蛋白质作为诊断原发性小肝癌的特异性蛋白可将正常人及小肝癌患者准确分组,具有高敏感性和特异性。且M/Z值为7771.17Da蛋白质在小肝癌组中低表达,在正常人组中高表达。
2.5 特异性及敏感性的相关分析 运用Flex Analysis和BioTools软件进行分析,M/Z值为7771.17Da的蛋白质作为诊断原发性小肝癌的特异
性蛋白,其敏感性为91.0%,特异性为70.0%。
表1 小肝癌组与正常人对照组有55个差异蛋白质
表2 GA结果
表3 QC结果
表4 SVM结果
表5 SNN结果
表6 交叉验证
表7 识别能力检测
3 讨 论
肝癌早期诊断即小肝癌诊断对肝癌治疗及预后起着至关重要的作用,肝癌的早期筛查有助于降低肝癌病死率[9]。近年,随着实验室技术及影像诊断技术的发展,原发性肝癌的诊断已经从“临床诊断”进展到“亚临床诊断”。20世纪70年代初,甲胎蛋白(Alpha-fetoprotein,AFP)的临床应用使肝癌诊断向前迈进了一大步。然而,大量临床资料表明肝癌患者AFP阳性率波动于60%~70%[10],小肝癌中血清AFP阴性的肝癌患者也较常见[11],且部分肝癌患者病程中AFP值呈持续低浓度阳性。同时,正常妊娠、活动性肝炎、生殖系统和胃肠系统的恶性肿瘤等血清AFP值亦升高。以上表明甲胎蛋白在原发性小肝癌诊断的实际应用中,存在相当程度的阴性及假阳性问题。20世纪80年代,超声(ultrasonic)、计算机断层摄影(CT)、核磁共振成像(MRI)等影像诊断技术的应用使肝癌的亚临床诊断成为可能。同样,以上任何一种影像诊断技术都受到仪器性能、肿瘤发展程度、影像学技师技能、临床经验等因素的影响,且影像诊断筛查结果最终需得到病理诊断的进一步支持。
近期,关于肝癌的基础研究也是十分活跃据,然而肝癌发生的机理十分复杂,至今发现的基因和蛋白质表达异常虽然多见,但尚未据此形成更为可靠的预测手段[12]。生命科学进入后基因组时代为科研工作者提供了更高的平台,从多肽、核酸、纯化蛋白质等基因水平探讨一种疾病的发生发展已经提上日程。如何寻找具有高灵敏度和高特异性的蛋白质是原发性小肝癌早期诊断的关键所在,采用基质辅助激光解析/电离飞行时间质谱 (MOLDI-TOF-MS)技术对原发性小肝癌患者与正常人血清蛋白质谱进行分析,得到高敏感性和特异性的血清蛋白,且能将小肝癌与正常人较准确的分开,建立诊断模型指纹图谱,为小肝癌的临床诊断及治疗提供积极因素。
本研究利用MOLDI-TOF-MS技术和Flex Analysis和BioTools分析软件,对35例原发性小肝癌血清标本与50名正常人血清样本进行对比,结果显示:在0~100000 Da质荷比范围内,小肝癌组与正常人组有显著性差异的蛋白质峰为55个 (P<0.05),两组有非常显著性差异的蛋白质峰为30个(P<0.01);通过交叉验证,结果以M/Z值为7771.17 Da的蛋白质,具有较高敏感性和特异性,可将正常人及小肝癌患者准确分开,且M/Z值为7771.17Da蛋白质在小肝癌组中低表达,在正常人组中高表达。再以M/Z值为7771.17 Da蛋白质作为生物标记,随机抽取小肝癌与正常人血清标本进行双盲验证,结果表明此蛋白质作为生物标记物可以将肝脏肿瘤与非肿瘤准确地分组,其敏感性为91.0%,特异性为70.0%。
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