参知健脑胶囊单次灌胃给予小鼠的毒性试验

2012-10-17马大勇韩振蕴

中国医药导报 2012年12期

舒忻马大勇林彬韩振蕴

1.北京中医药大学东方医院脑病科，北京 100078；2.北京中医药大学东直门医院脑病科，北京 100700

参知健脑胶囊主要用于血管性痴呆“正气亏虚兼浊毒络阻”证。症见智力减退、思维迟钝、神情呆滞、健忘，或喜怒不定、心烦汗出、躁扰不安、少寐多梦等。为考察小鼠单次灌胃给予供试品后的急性毒性反应，为该药的临床前反复给药的毒性研究和临床研究提供参考信息而进行本试验。现将试验总结如下：

1 材料与方法

1.1 实验药物

参知健脑胶囊（批号：20100907，有效期至2012年3月7日），由人参茎叶总皂苷、知母提取物和赤芍提取物等按一定比例配伍而成，由北京中医药大学中药学院提供；灭菌注射用水（批号：20100701，有效期至2012年7月2日），由北京立时达药业有限公司生产。

1.2 实验动物

4～5周龄SPF级昆明小鼠，雌雄各20只，体重雌性18.5～20.5 g，雄性：18.6～21.5 g，所有动物体重均不超过或低于同性别动物平均体重的20%。实验动物使用许可证号：SYXK（京）2009-0024。

1.3 动物饲养与管理

所有动物购入后，经兽医接收进行检疫；SPF级环境动物房；标准SPF级鼠饲料（供应单位：北京科澳协力饲料有限公司；动物饲料生产许可证号：SCXK（京）2009-0012）；动物饮用纯化水，用饮水瓶供应；刨花材质的实验室专用垫料；动物饲养于装有垫料的聚丙烯鼠盒中，鼠盒规格为长×宽×高＝295 mm×195 mm×125 mm，雌雄分养，每盒最多饲养同性别5只动物。动物自由摄食，自由摄水；设定的动物房温度范围是20～25℃，实测温度范围是20.0～23.2℃。设定的动物房湿度范围是40%～70%，实测湿度范围是40%～60%。光照12 h明暗交替；垫料每周更换2次，同时更换鼠盒。每天更换高压消毒过的饮水瓶和瓶塞。所有换洗的笼具清洗过后均采用高压灭菌；笼架每周消毒1次，动物房地面每天消毒1次，动物房墙面每周消毒1次，用0.1%新洁尔灭或0.5%的84消毒液擦拭消毒，两种消毒液交叉使用，每周交叉1次。

1.4 实验方法

1.4.1 实验分组给药前从44只动物中挑选检疫合格、体重相近的雌雄各20只动物，用区段随机分组法，按性别将动物分为两个区段，用Excel软件给予每只动物一个随机数，并按照随机数从小到大的排序，将小鼠分为两组，即阴性对照组和供试品组每组，雌雄各10只，其中阴性对照组动物给予灭菌注射用水。见表1。

1.4.2 供试品配制及给药称取适量的供试品，用灭菌注射用水溶解，配成终浓度为200 mg/mL的供试品溶液。溶解后的供试品常温保存；给药途径为灌胃，给药频率为单次给药，给药容量为25 mL/kg，给药方法为动物灌胃前禁食过夜，药后再禁食1 h。用一次性使用1 mL无菌注射器准确抽取所需溶液，用12号灌胃针经口灌胃给药；给药方式选择的理由是临床拟用途径为口服，本试验采用经口灌胃给药，与临床拟用途径基本相同。

表1 动物的组别、剂量和动物号

1.5 检测指标

1.5.1 临床观察给药后笼旁观察，1 h内连续观察，每15 min记录1次，1～4 h内每1 h观察1次；4 h后结束观察；其他观察时间：检疫驯养期和给药后次日开始，每天上午和下午各进行1次一般临床观察，第7天和第14天进行详细临床观察，观察期为14 d。在同一时间段，一般临床观察与详细临床观察不重复实施。一般临床观察内容主要包括笼旁观察动物死亡或濒死情况、精神状态、行为活动、进食情况、粪便性状等；详细临床观察内容：精神状态、行为活动、皮肤、被毛、眼、耳、鼻、腹部、外生殖器、肛门、四肢、足和呼吸等。

1.5.2 体重给药前、第8天、第15天测定动物体重。

1.5.3 食量每周加料1次，第8天、第15天称取每笼剩余饲料量，据加料量和剩余饲料量算出平均每天每只动物食量，以 g/只/天表示。

1.5.4 病理检查所有动物均进行大体解剖，大体解剖所见异常的组织器官进行组织病理学检查。

1.6 动物安乐死方法

观察期结束（第15天）所有存活动物，使用CO2吸入麻醉法将动物麻醉，之后股动脉放血安乐死。

1.7 统计学方法

采用SPSS 13.0统计学软件，，计量资料数据以均数±标准差（±s）表示，分析动物体重和食量的变化趋势，根据病理检查和临床观察结果，综合判断供试品的急性毒性反应情况。动物体重进行独立样本的t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床观察

给药后，连续观察4 h，动物呼吸平稳、活动正常，未见异常反应。14 d的观察期间，未见动物发生死亡或濒死，各组动物精神状态、行为活动等均未见明显异常。

2.2 体重

试验期间，各组动物的体重增长趋势相似，供试品给药组动物体重与同期同性别阴性对照组动物比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 参知健脑胶囊单次灌胃给予小鼠体重变化情况（±s，g）

性别组别剂量（mg/只）只数给药前第8天第15天雌性0雄性阴性对照组供试品组阴性对照组供试品组5 000 0 5 000 10 10 10 10 19.6±0.6 19.4±0.8 19.7±0.8 19.3±0.6 28.1±1.1 28.3±1.8 34.3±2.7 32.0±2.2 31.6±2.2 32.0±1.8 41.8±3.2 39.1±3.0

2.3 食量

供试品组与同期同性别阴性对照组动物的摄食量相似，未见药物对动物食量有明显影响。见表3。

表3 参知健脑胶囊单次灌胃给予小鼠食量变化情况（±s，g/只/天）

性别组别剂量（mg/只）只数第1周第2周雌性0雄性阴性对照组供试品组阴性对照组供试品组5 000 0 5 000 2222 4.80±0.14 4.85±0.07 6.50±0.14 6.00±0.00 4.85±0.35 5.05±0.21 7.25±0.07 6.90±0.28

2.4 病理检查

所有动物均按计划安乐死，进行大体解剖观察，各组织脏器均无肉眼可见异常改变。

2.5 影响研究可靠性和造成研究工作偏离实验方案的异常情况

试验中未见可能影响研究可靠性和造成研究工作偏离试验方案的异常情况。

3 讨论

参知健脑胶囊是以王永炎院士提出的血管性痴呆“正虚毒损络阻”创新病因病机学说为指导研发而得[1-4]，主要由人参、知母、赤芍等药物提取物按一定比例优化配伍而成[5]，具有扶正、通络、解毒的功效[6-7]，是国家重大新药创制项目的候选新药。

现代研究发现，人参皂苷具有提高拟痴呆模型动物的学习记忆能力、改善脑内神经递质的含量及作用、减少神经细胞凋亡、保护海马神经元和突触、增加血管新生、保护脑损伤等作用[8-12]，知母提取物能够改善痴呆动物的学习记忆能力、良性调节痴呆动物的胆碱能系统及清除自由基等[13-17]。芍药提取物可以提高痴呆动物的学习记忆能力，对神经细胞缺氧、缺糖、氧自由基及一氧化氮神经毒性等损伤有显著保护作用[18-20]。

前期动物研究中发现，参知健脑胶囊可明显改善大鼠的学习、记忆功能，减轻其海马CA1区神经细胞损伤，增加痴呆大鼠海马组织中Ach的水平[21]，并可通过降低细胞内ROS水平，拮抗Aβ引起的细胞毒性，抑制细胞凋亡，而具有治疗神经退行性疾病的功效[6]。

在本试验条件下，参知健脑胶囊单次灌胃给予昆明小鼠，在5 000 mg/kg的剂量下，未见小鼠出现毒性反应。按体重计算，此剂量相当于临床拟用剂量的286倍。说明参知健脑胶囊安全剂量范围较广，安全性较好。

[1]王永炎.关于提高脑血管疾病疗效难点的思考[J].中国中西医结合杂志，1997，17（2）：195-196.

[2]唐启盛.“浊毒痹阻脑络”对老年期痴呆的影响[J].北京中医药大学学报，1997，20（6）：24-25.

[3]李澎涛，王永炎，黄启福.“毒损脑络”病机假说的形成及其理论与实践意义[J].北京中医药大学学报，2001，24（1）：1-6.

[4]谢颖桢，邹忆怀，张云岭.血管性痴呆病因病机探讨[J].北京中医药大学学报，2000，23（6）：1-3.

[5]杨傲然，田昕，钟华，等.参知健脑片有效组分的最佳配伍筛选[J].中华中医药学刊，2009，27（12）：2600-2602.

[6]钟华，杨傲然，王宝见，等.参知健脑片组分对β淀粉样蛋白致SHSY5Y 细胞凋亡的保护作用[J].山东医药，2009，49（31）：22-24.

[7]杨傲然，田昕，钟华，等.参知健脑片组方配伍对Aβ致阿尔茨海默病细胞模型细胞周期和凋亡率的影响[J].中华中医药学刊，2010，28（3）：562-564.

[8]张晓东，李万亥.人参皂甙Rg1 Re对淀粉样蛋白诱导原代培养海马及皮质神经元损伤的保护作用[J].第二军医大学学报，2000，21（10）：941-943.

[9]陈丽敏，陈晓春，林挺岩，等.人参皂甙Rgl可能通过CDK4-pRB-E2Fl通路减少神经元凋亡[J].中国药理学通报，2002，18（6）：695-700.

[10]申丽红，张均田.人参皂甙Rgl对脑缺血沙土鼠神经干细胞存活率和学习记忆能力的影响[J].中南药学，2004，2（1）：6-9.