六味地黄滴心丸总糖含量测定

闫 荟 杨立红 王苏会 张瑞淑

1.北京军区总医院药剂科，北京 100700；2.北京军区药品器材供应站，北京 100700；3.北京军区司令部门诊部，北京 100144

六味地黄滴心丸是六味地黄丸的改进剂型，六味地黄是补肾经典名方，具有滋补肾阴之功效，常用于治疗肾阴不足之证。六味地黄由熟地黄、山茱萸、山药、泽泻、牡丹皮及茯苓六味中药组成，其每一味药材中都含有多糖[1-6]。近年研究表明，多糖是其免疫促进作用的主要有效成分之一，相对分子量为3万左右[7]。为此，笔者认为对多糖进行含量测定有利于保证六味地黄制剂的质量。但因多糖组成复杂，得到对照品较困难，目前多采用单糖如葡萄糖测定样品中多糖的相对含量，且由于多糖本身无法直接测定，只有水解为葡萄糖后才能测定。为准确起见，本研究定为测定其总糖含量，并进行方法学考察，现报道如下：

1 仪器与试药

1.1 仪器

TU-1201型紫外分光光度计（北京市通用仪器设备公司）；AY220型SHIMADZ托盘分析天平（日本岛津公司）。

1.2 试药

六味地黄滴心丸（北京军区总医院制剂中心生产，批号：090115、090116、090117）；无水葡萄糖对照品（批号：110833-200302）；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

参照有关文献，总糖含量测定采用蒽酮-硫酸比色法[8-9]，照紫外-可见分光光度法[10]测定。

2.1 供试品溶液的制备

取六味地黄滴心丸20丸，研细，取1 g，精密称定，加水100 mL回流提取2次，每次1 h，滤过（用热水洗涤残渣），合并滤液，浓缩，转移至100 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀。精密量取2 mL，置50 mL容量瓶中，加水稀释至刻度，定容，摇匀，即得。

2.2 对照品溶液的制备

精密称取无水葡萄糖对照品6.25 mg，加纯化水于25 mL量瓶中，制成每1 mL含0.25 mg的溶液，溶解，定容，摇匀，即得。

2.3 空白对照溶液的制备

按剂型原辅料的配制比例，精密称取变性淀粉适量，加水制成空白对照溶液即得。

2.4 蒽酮-硫酸试液的制备

称取蒽酮0.5 g溶于2 mL乙酸乙酯中，振摇溶解，加入80%硫酸溶液至250 mL，充分振摇溶解，置棕色瓶中密塞备用。

2.5 测定波长的选择

精密吸取对照品溶液1.0 mL，供试品溶液1.0 mL，分别置干燥具塞试管中，以纯化水1.0 mL作空白对照；每管分别加纯化水至2.0 mL，再分别精密加入0.2%蒽酮-硫酸试液4.0 mL。立即摇匀，放冷至室温，显色后，用紫外分光光度计于400～800 nm范围扫描，结果对照品溶液、供试品溶液显色后扫描图谱基本相似，均在625 nm左右有最大吸收，空白对照溶液无吸收，故选择625 nm作为样品的测定波长。见图1。

2.6 标准曲线的绘制

精密吸取对照品溶液（0.268 mg/mL）0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分别置10 mL容量瓶中，各加水至2.0 mL，再加0.2%蒽酮-硫酸溶液稀释至刻度，摇匀，放冷至室温。以试剂为空白，在625 nm处测定其吸光度，以吸光度（Y）为纵坐标，浓度（X）为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为Y=32.257X＋0.001 7，r＝0.999 8。结果表明葡萄糖浓度在0.005 4～0.026 8 mg/mL范围内，呈良好的线性关系。见图2。

2.7 测定方法

精密吸取样品溶液1.0 mL，置10 mL容量瓶中，照“2.6”项下标准曲线的制备进行，自“加水至2.0 mL”起操作，测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中总糖的含量，计算，即得。

2.8 精密度试验

取标准曲线试验项下的对照品溶液，按“2.7”项下测定方法，重复测定6次。见表1。

表1 精密度试验结果（n=6）

2.9 稳定性试验

取供试品溶液，按“2.7”项下测定方法，分别于 0、30、60、90、120 min测定吸光度，结果供试品溶液在120 min内基本稳定。见表2。

表2 稳定性试验测定结果（n=5）

2.10 重复性试验

取六味地黄滴心丸样品，按“2.7”项下测定方法，重复测定6份。见表3。

表3 重复性试验测定结果（n=6）

2.1 1准确度试验（即回收率试验）

采用加样回收率试验，取已知含量的样品6份，分别加入无水葡萄糖对照品200 mg，按“2.7”项下测定方法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中总糖的含量，计算回收率。见表4。

表4 回收率试验测定结果（n=6）

2.12 含量测定

取六味地黄滴心丸，按“2.1”供试品溶液的制备方法制备样品溶液，按“2.7”项下测定方法，测定3批样品。见表5。

表5 样品中总糖的测定结果（n=3）

3 讨论

多糖含量的测定方法有苯酚-硫酸法、地衣酚-硫酸法、Somogyi-Nelson法、蒽酮-硫酸法等[11]。其中苯酚-硫酸法是常用测定多糖含量的方法，可用于甲基化糖、戊糖和多聚糖等的测定，方法简单，准确性较好，灵敏度高，适用面较广，实验时基本不受蛋白质存在的影响，并且产生的颜色可稳定160 min以上[7-9]，但其亦存在缺陷，因苯酚易氧化，见光或遇氧即逐渐氧化成淡红色，在测定中须避光或操作迅速，只有在稳定和熟练的操作情况下才能获得理想的重现性。

本实验采用蒽酮-硫酸法，原理是糖类在硫酸作用下脱水生成糖醛或其衍生物后，与蒽酮试剂迅速而完全地缩合成稳定的蓝绿色糖醛衍生物，其生成量与多糖含量存在定量关系，灵敏度高且快速。蒽酮-硫酸法几乎可以测定所有的碳水化合物，所以用该法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。因此，蒽酮-硫酸法测定结果可能偏高[9]，但蒽酮试剂较稳定，且试液在120 min内显色稳定，重现性好，该方法可以作为六味地黄滴心丸中多糖含量测定的方法。

实验过程中，在使用硫酸-蒽酮显色剂时，由于蒽酮见光易分解，因此，蒽酮-硫酸溶液必须现用现配。另外，样品测定时，试管中加入蒽酮-硫酸溶液后，由于放热反应试管温度急剧升高，试管可用自来水冲洗冷却。

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