致仔猪腹泻大肠杆菌的耐药性与质粒谱分析

刘玉芹，陈翠珍，杨彩然，贾青辉，董淑珍，李 蓉，郑新羽，房 海

(河北科技师范学院动物科技学院，河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛，066600)

抗菌药物是目前防治仔猪大肠杆菌性腹泻病的主要手段，因此出现了大肠杆菌耐药谱不断扩大，多重耐药情况非常严重的现象。细菌通过质粒的接合、转化、转导等方式获得新的耐药性是造成耐药现象严重的一个重要原因［1］。大肠杆菌是可由质粒介导产生耐药性的细菌之一，可携带含有多种耐药表型的R质粒，并进行横向传播，从而造成耐药性的菌间传递，给疾病的防控带来困难［2］。因此，对菌株的耐药性及质粒特征的研究有助于预防和控制细菌耐药性的发生和蔓延。本试验对分离自河北省5个不同市县的12株猪源大肠杆菌进行了15种抗生素的耐药性检测，并提取质粒，进行了耐药谱和质粒谱型的比较分析，探讨大肠杆菌耐药性与质粒图谱之间的关系。

1 材料与方法

1．1 试验菌株及质控菌株

2009年分离自河北省沧州、石家庄无极、石家庄正定、邯郸、衡水等不同地区的已经过系统鉴定、致病性检验和药敏试验的猪源大肠杆菌12株。质控菌株:ATCC25922由河北科技师范学院预防兽医学重点实验室保存。

1．2 培养基及药品试剂

15种药敏纸片购自杭州天和微生物试剂有限公司;LB肉汤、MH肉汤、MH琼脂和麦康凯琼脂购自北京陆桥技术责任有限公司;λDNA/HindⅢMarker、Goldview、琼脂糖、Tris等购自东盛生物有限公司;质粒小提试剂盒购于康为世纪生物科技有限公司。

1．3 药物敏感性测定

采用临床实验室标准化协会(CLSI)推荐的琼脂扩散法(K-B)测定38株大肠杆菌对15种常用抗菌类药物的敏感性，并以大肠杆菌ATCC25922进行质控。参照CLSI(2009)公布的标准，以敏感、中介、耐药等3种形式对抑菌圈作出判定，个别CLSI没有列出。但我国人医或兽医仍使用的药物按杭州天和微生物试剂有限公司提供的标准解释。

1．4 质粒的提取

按照质粒小提试剂盒说明提取质粒。以λDNA/HindⅢ为Marker，以TAE为缓冲液，采用110 V电压，质量浓度7 g·L－1的琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪成像，对提取的质粒进行鉴定。

1．5 质粒DNA大小的测定

按 Hanse等［3，4］方法进行。以标准 λDNA/HindⅢ酶切片段(其分子量分别为 23．10 ×103，9．40 ×103，6．60 ×103，4．40 ×103，2．30 ×103，2．00 ×103，0．60 ×103bp)的电泳结果为标准系统，以迁移率为自变量，碱基数的对数为因变量建立回归方程，换算出质粒及酶切片段的碱基数。

2 结果与分析

2．1 大肠杆菌的耐药性

分析12株猪源大肠杆菌对15种临床常用药物的药敏试验结果，分离菌株对氨苄西林的耐药率达到了100%，对阿莫西林的耐药率为91．7%，对四环素和复方新诺明的耐药率介于50%～70%。分离菌对阿米卡星、头孢唑啉、链霉素和呋喃唑酮的敏感率为100%(表1)。

分析12株大肠杆菌的耐药谱，分离到的猪源大肠杆菌存在多重耐药性，12株菌对15种药物中的一种或多种药物耐药，无一全部敏感(表2)。其中，最少的对2种药物耐药，最多的对7种药物耐药，以耐4种、6种和7种药物为主，占总数的75%，这与一些抗菌药物在生产中的长期使用有关。

2．2 大肠杆菌的质粒图谱

12株分离大肠杆菌用试剂盒提取质粒，经琼脂糖凝胶电泳检测结果(图1，表1)。耐药菌株的质粒携带率为100%，所有菌株均含有大小和数量不等的质粒，最多4个，最少1个，质粒大小在1．32×103～17．6×103bp之间。只携带了1个质粒的菌株有2株，2个质粒的有7株，3个质粒的有2株，4个质粒的有1株。

2．3 质粒谱与耐药谱关系分析

分析12株大肠杆菌的耐药谱与质粒谱的关系，可以发现，耐药谱的宽窄与其所携带质粒数的多少没有明显的正相关关系(表2)。耐药谱窄的菌株，其所含质粒数不一定少，如1号菌;耐药谱宽的菌株，其所含质粒数也不一定多，如6号菌。说明1个质粒可能包含多个不同的耐药基因，而同一个耐药基因也可能存在于多个不同的质粒中。质粒谱相同的菌株其耐药谱可以相同，也可以不同，如8号9号10号菌株。质粒谱不同的菌株其耐药谱也可以相同，如4号和5号菌株。同样分析其他的菌株也可以出现类似的结果。

表1 12株猪源大肠杆菌的耐药情况

图1 大肠杆菌质粒图谱

表2 大肠杆菌的耐药谱及质粒谱

3 讨 论

大肠杆菌是革兰氏阴性菌中最易产生耐药性的细菌，本次对8大类15种常用抗菌药物对河北省不同地区发病猪场分离到的12株大肠杆菌耐药性进行调查，结果表明，分离菌株全部为耐药菌株，且对氨苄西林和阿莫西林均显示极高的耐药性(耐药率高于90%)。养殖场用药模式对场内细菌耐药性具有较大影响。近年来阿莫西林和氨苄西林在兽医临床的广泛使用导致了耐药菌株的大量出现，这些药物的高耐药率，已使他们失去了治疗价值，建议停用。分离菌对阿米卡星、头孢唑啉和链霉素等临床投入使用不久或未大量使用的药物敏感率达到了100%，这些药物可供临床选择用药参考。

对分离菌的耐药谱做进一步分析发现，该菌存在广泛的多重耐药性，12株大肠杆菌分离株共有9种耐药谱，耐药谱有增宽的趋势，且相同耐药程度的分离株存在多个不同谱型，如4重耐药菌株有3种谱型，耐药谱完全相同的分离株最多2株，大多数分离株都具有不同的耐药谱。这表明养殖场中用药情况非常复杂。复杂的用药情况是细菌产生多重耐药性的一个重要原因。这也表明在养殖过程和临床用药中不要凭经验，最好对相应病例分离株做药物敏感性测定以保证治疗的最佳效果。

质粒图谱分析技术是通过分析细菌所携带质粒的数量、大小等特点进而对该病原菌进行追踪、分型的现代分子生物学技术，可用于爆发流行菌株鉴定，其特异性和敏感性优于血清学分型、药物敏感性分型等依赖于细菌表型特征的分型方法［5］。由于细菌耐药性的一部分是由质粒决定的，因此质粒指纹图谱法也常用于分析耐药菌株的内在相关性［6］。

本试验中通过对各菌株的耐药谱和质粒图谱进行对比分析，发现细菌的耐药谱与质粒图谱的条带数并不成正相关关系，如6号菌，质粒图谱只有1个条带，但耐药谱却高达6种药物;有些菌株质粒图谱条带数虽多，但其耐药性却不强，如1号菌质粒图谱有4个条带，但耐药谱却仅有3种药物。分析其原因可能是细菌的耐药基因并不完全存在于质粒上，或者细菌的1个质粒就可能包含多个不同的耐药基因，而使该细菌表现出对多种药物的耐药性。而同1个耐药基因也可能存在于多个不同的质粒中。本试验的结果与王永芬等［7］、赵增成等［8］的研究结论一致，即细菌的质粒携带与细菌的耐药性之间并没有明显的对应关系。

4 结 论

分离自河北省5个不同市县的12株猪源大肠杆菌全部为耐药菌株，对氨苄西林和阿莫西林的耐药率高于90%，对四环素和复方新诺明的耐药率介于50%～70%。分离菌株存在广泛的多重耐药性，以耐4种、6种和7种药物为主，占总数的75%。对分离菌株耐药谱与质粒谱的分析表明，大肠杆菌的质粒携带与细菌的耐药性之间没有明显的对应关系。

［1］赖婧，刘洋，汪宇，等．800株不同动物源大肠杆菌的耐药性监测［J］．中国兽医杂志，2011，47(4):12-14．

［2］房海，陈翠珍，张晓君．肠杆菌科病原细菌［M］．北京:中国农业科学技术出版社，2011．

［3］HANSE J B，OLSEN R H．Isolation of large bacterial plasmids and characterization of the P2 incompatibility group plasmids PM G1 and PM G5 ［J］．J Bacteriol，1973(135):227-230．

［4］江文正，韩文瑜，王世若，等．猪致病性大肠杆菌的质粒指纹图谱分析［J］．中国兽医学报，1998，18(5):475-478．

［5］张玉霞，徐怀英．家禽大肠杆菌分型方法研究进展［J］．家禽生态学报，2011，32(5):98-100．

［6］张志坚，郭小兵，张钦宪．产ESBL大肠埃希氏菌质粒谱与耐药性分析［J］．第四军医大学学报2008，29(21):1 970-1 972．

［7］王永芬，白静，边传周．鸡致病性大肠杆菌耐药性与质粒图谱的分析研究［J］．黑龙江畜牧兽医，2007(1):71-72．

［8］赵增成，林树乾，黄兵等．山东地区鸡源型大肠杆菌的耐药性与质粒图谱的监测分析［J］．家禽科学，2009(10):42-44．