不带电荷极性氨基酸对兔肝中碱性磷酸酶活性的影响

张艳英，关学敏

(河北科技师范学院动物科技学院，河北省预防兽医学重点实验室，河北秦皇岛，066600)

碱性磷酸酶(alkalinity phosphoric简称AP)是一种能催化多种磷酸脂类化合物并能水解释放无机磷的酶，广泛存在于动物血液和各种器官内，在骨骼形成以及脂肪合成过程中起重要作用，己作为动物生理活动和疾病诊断的一项重要指标［1］，如当鸡发生佝偻症时血清的碱性磷酸酶活性异常升高［2］。它还是一种底物专一性较低的磷酸单脂酶，在生物体内直接参与了磷酸基团的转移和代谢过程，维持体内适宜的钙磷比例，并且在脊椎动物的骨化过程中发挥了重要作用［3，4］。为了满足生产实践上的需要，国内以鸡组织为材料来分离纯化AP并对其性质进行分析的研究工作即已有很多［5，6］，笔者在此基础上进一步研究几种不带电荷极性氨基酸对兔肝中AP活性的影响。

1 材料与方法

1．1 试验材料及试剂

1．1．1 试验器材 冷冻离心机(型号GL-20G-Ⅱ，购自上海安亭科学仪器厂)，722分光光度计(型号ST-20606010601，购自上海精密仪器有限公司)。

1．1．2 试验试剂及其配制 新鲜兔肝(河北科技师范学院动物科技学院试验室提供)，0．5 mol/L醋酸镁溶液，0．1 mol/L 醋酸钠溶液，0．01 mol/L 醋酸镁-0．01 mol/L 醋酸钠溶液，Tris-HCl pH 8．8 缓冲液，酚标准溶液，40 mmol/L底物溶液，酶液:D管稀释5倍，0．5 mol/L氢氧化钠溶液，质量浓度为3 g/L的4-氨基安替比林(AAP)溶液，质量浓度为5 g/L的铁氰化钾溶液，Folin-酚试剂甲，Folin-酚试剂乙，10 mmol/L的甘氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺和丝氨酸。

标准蛋白质溶液:取结晶牛血清白蛋白溶于蒸馏水，质量浓度为250 mg/L。

1．2 试验方法

1．2．1 AP的分离纯化 按照生物化学中的有机溶剂分级沉淀法进行。以下操作均在4～10℃进行。

①称取新鲜兔肝(清除结缔组织)2 g，剪碎后，置于玻璃匀浆器中，加入2．0 mL 0．01 mol/L醋酸镁-0．01 mol/L醋酸钠溶液，充分磨成匀浆后，将匀浆液转移到离心管中，用4．0 mL上述溶液分2次冲洗匀浆管，并倒入离心管中，混匀，加2．0 mL正丁醇，用玻璃棒充分搅拌约2 min，然后在室内放置20 min后，滤纸过滤，滤液置离心管中，于滤液中加入等体积冷丙酮，立即混匀后离心5 min(2 000 r/min)，弃上清液，向沉淀中加入4．0 mL 0．5 mol/L醋酸镁溶液，用玻璃棒充分搅拌使其溶解。

②量悬液体积，并计算使乙醇终体积分数至0．30需要加入的体积分数为0．95冰乙醇的量。按计算量加入乙醇，混匀，立即离心5 min(2 000 r/min)，量取上清液体积，倒入另一离心管中，弃去沉淀。向上清液中加入体积分数为0．95的冰乙醇，使乙醇终体积分数达0．60，混匀后立即离心5 min(2 500 r/min)，弃上清液。向沉淀中加入4．0 mL 0．01 mol/L醋酸镁-0．01 mol/L醋酸钠溶液，充分搅拌，使其溶解。

③重复②操作，向悬浮液中加入冷乙醇(体积分数为0．95)，使乙醇终体积分数达0．30，混匀后立即离心5 min(2 000 r/min)，计算上清液体积，倒入另一离心管中，弃去沉淀，向上清液中加入体积分数为0．95的冷乙醇，使乙醇终体积分数达0．60，混匀后立即离心5 min(2 500 r/min)，弃上清液，沉淀用3．0 mL 0．5 mol/L醋酸镁充分溶解，记录体积，此为C1液。吸取C1液0．2 mL置于编号为C1的试管中，加入3．8 mL Tris缓冲液(pH 8．8)，供测酶活性用。

④向上述剩余悬浮液中逐滴加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达0．33，混匀后离心5 min(2 000 r/min)，弃去沉淀。量取上清液体积后转移至另一离心管中，再缓缓加入冷丙酮，使丙酮终体积分数达到0．50，混匀后立即离心5 min(4 000 r/min)弃上清液，沉淀为部分纯化的AP。像此沉淀中加入4．0 mL Tris pH 8．8缓冲液使沉淀溶解，再离心5 min(2 000 r/min)将上清液倒入试管中，记录体积，弃去沉淀。上清液即为部分纯化的酶液，此为D1液。吸取0．2 mL D1液置于编号为D1的试管中，加入0．8 mL Tris缓冲液(pH 8．8)，供测酶活性用。

⑤再称取另一只兔的新鲜兔肝2 g，进行以上①～④的步骤，得到C2，D2液，供测酶活性用。

1．2．2 AP的活性测定 按照金氏法进行，并做适当改进。

取6支试管，按表1进行。

充分摇匀，室温放置10 min，于波长510 nm处比色测定。以下式计算每毫升酶液的酶活性单位数。

酶活性单位数=(样品OD510/对照OD510)×酚标准溶液的质量浓度×1/(0．1×稀释倍数)

其中，酶活性单位数的单位:mL;酚标准溶液的质量浓度的单位:g/L。

表1 AP的活性测定 mL

1．2．3 AP的含量测定及比活性计算 按Folin-酚法进行，并做适当的改进。

①标准曲线的绘制 当加入Folin-酚试剂乙时，边加边摇，迅速混匀，室温下放置30 min，以1号管为空白对照(表2)，于650 nm处比色。记录数据，以标准蛋白含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线。

表2 标准曲线的绘制

②样品测定 于2支洁净干燥的试管中，分别加入待测样品各1 mL，加试剂甲、乙及比色操作步骤与①方法相同。

由待测样品所得OD值，查标准曲线，求得AP含量，再乘以稀释倍数，即可获得样品的AP含量。

③比活性计算

AP的比活性=每毫升样品AP活性单位数/每毫升样品蛋白质质量(mg)

1．2．4 AP的最适温度的测定 调节恒温水浴锅，设置不同温度，按上述方法测定酶活力后求出最适温度。

1．2．5 AP的最适pH值的测定 在最适温度(上一步已测出)条件下，在Tris-醋酸缓冲液的不同pH值下，按上述方法测定酶活力及比活力后求出最适pH值。

图1 标准蛋白与OD值的标准曲线

1．2．6 不带电荷极性氨基酸对AP活性的影响 在反应体系中分别测定相同浓度(10 mmol/L)下甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺对AP的影响，按上述酶活性的测定方法分别测定其活性。

2 试验结果

2．1 AP 的含量

2．1．1 蛋白浓度标准曲线 由表2数据根据试验方法1．2．3部分中的表2和1．2．3部分中的步骤②计算得出数据并绘图(图1)。

2．1．2 样品中AP含量的测定 根据图1所得蛋白的质量浓度标准曲线计算得出样品蛋白的质量浓度(表3)。

表3 样品蛋白的质量浓度

2．2 AP的最适温度

根据试验方法中 1．2．2 和 1．2．3 的步骤③，得到各个温度下的AP活力及比活力(表4)。由表4作图2。

表4 温度与酶活力的关系

从图表中可以看出，当温度升高或降低时酶的活性也随之变化，AP的最适温度是39℃，而兔子的正常体温在38．5～39．5℃之间，试验结果也在其范围之内。但是试验中存在一定误差，所以图像不是规则的抛物线。

2．3 AP的最适pH值

在最适温度下根据试验方法1．2．5和1．2．3的步骤③，得到各个pH值下的AP活力及比活力(表5)。

由表5作pH值与酶活力的关系曲线(图3)。从图中可以看出，当pH值升高或降低时酶的活性也随之变化，碱性磷酸酶的最适pH值是9．84。

2．4 测定不带电荷极性氨基酸对AP活性的影响

根据试验方法1．2．6得到表6数据，由处理数据绘制图4。通过测定相同浓度下不同氨基酸对AP的抑制作用，可见天冬氨酸和半胱酰胺的抑制作用是最大的。

图2 温度与平均酶活力的曲线关系

表5 pH值与酶活力的关系

表6 不带电荷极性氨基酸与酶活性的关系

图3 酶活力与pH值曲线

图4 不带电荷极性氨基酸与酶活力的关系

3 讨 论

从AP含量试验和AP最适温度、最适pH值试验中可见已经分离纯化到较为纯净的AP。

AP的酶学特性因动物种属不同而异，本次试验结果表明，兔肝中AP的最适温度和最适pH值分别为39℃和9．84。与其他动物来源的AP有一些差异，白蜡虫(雌成虫)37℃，8．5［7］;三黄鸡(肝)40℃，10．5［8］;黑眉锦蛇(小肠)36 ℃，9．5［9］。

在最适温度和最适pH条件下，相同浓度的甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、天冬酰胺对AP活性的影响试验中可知，半胱氨酸和天冬酰胺对AP的抑制作用是最大的，甘氨酸的抑制作用相对较小，苏氨酸的抑制作用最小，其具体的抑制作用表现为:半胱氨酸＞天冬酰胺＞甘氨酸＞苏氨酸，而丝氨酸则表现有略微的激活作用。一般说来，氨基酸对AP的抑制具有立体异构专一性，只有L-氨基酸才有明显的抑制作用［10，11］。在测活体系的pH为10的条件下，氨基酸羧基解离带负电荷，可与酶活性部位附近的带正电荷的基团可逆结合，而阻碍了底物与酶活性中心的结合，从而抑制了酶活力;也可能由于氨基酸的侧链基团与酶的结合，导致酶分子构象的变化而影响酶的催化作用［11～13］。在同组试验小组中研究不同结构的氨基酸对于AP有不同的抑制作用，表明非极性疏水氨基酸中L-Iie的作用最强，而具极性的中性氨基酸作用最大的是L-Cys，而L-His是酸性和碱性氨基酸抑制作用最大的一种［14］。因此，氨基酸对AP抑制作用不仅与其侧链的理化性质有关，还与特殊的基团有关，如苯环、巯基等。

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