北方寒地草场中主栽苜蓿品种高效共生根瘤菌的筛选

杨旭升，马志军，郭春景

（1.黑龙江省科学院，黑龙江哈尔滨150001；2.黑龙江省科学院大庆分院，黑龙江大庆163316）

生物固氮每年为全球提供绝大多数的的氮素营养，其中大约80%是由共生固氮生物所固定的，而根瘤菌与豆科植物共生固氮是固氮作用最强的体系[1～3]。豆科牧草以其营养价值高，适口性好，有着很高的经济价值，在全世界范围内得到广泛种植，许多国家都以苜蓿作为重要的农牧业支柱作物。研究结果表明，在土壤氮素营养成分相同的条件下，一种根瘤菌并不能使不同苜蓿品种获得同样的接种效果，对一个苜蓿品种可以产生良好固氮效果的菌株，对另一苜蓿品种可能固氮效果一般，这种固氮效果的差异现象，说明根瘤菌与寄主植物之间需要很好的匹配，才能使苜蓿获得最佳的接种固氮效果[4～7]。陈文新院士等经过二十多年的研究，提出了有关根瘤菌与豆科植物共生关系的结论：同一种植物在不同生态环境中可与不同根瘤菌结瘤固氮，同一生态环境条件下不同植物可与同一根瘤菌共生固氮。因此，进行根瘤菌接种剂选种时，必须针对种植的生态环境及寄主植物两方面的因素，来选择与苜蓿最佳匹配的根瘤菌，而不是只考虑与寄主的匹配，并认为过去研究生物固氮只考虑与寄主植物的关系，很可能是接种效果不稳定的一个重要原因[8～12]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试的紫花苜蓿品种

巨人201苜蓿,金皇后苜蓿,驯鹿苜蓿,肇东苜蓿和敖汉苜蓿,共5个北方寒地草场中主栽的苜蓿品种,由黑龙江省科学院生物肥料研究中心保藏、提供。

1.1.2 供试的苜蓿根瘤菌菌种

SM29，SM30，SM32，SM33，SM35，SM36，SM37，SM38，SM39，SM40，SM41，共 11株，由黑龙江省科学院生物肥料研究中心保藏、提供。

1.1.3 供试蛭石

由河北灵寿源通矿产品加工厂生产。

1.1.4 试验用低氮营养液配方

0.03 g Ca (NO3)2，0.15g Na2HPO4，0.1g CaCl2·2H2O，0.12g MgSO4·2H2O，0.10g KH2PO4，0.05g 柠檬酸铁和 1 mL 微量元素(配方：2.86g H2BO3，1.81g MnSO4，0.80g CuSO4·5H2O，0.02g H2MoO4,1L 蒸馏水)。拌匀蛭石后，把蛭石装入耐高温的塑料杯中，连同供水系统在121℃条件下灭菌3h，获无菌蛭石。

1.1.5 根瘤菌YMA培养基

10g 甘 露 醇 ，0.25g K2HPO4，0.25g KH2PO4，0.2g MgSO4，0.1gNaCl，3gCaCO3，lL 蒸馏水，固体另加 1.5g琼脂粉，pH值6.8～7.2。

1.2 方法

1.2.1 菌株的培养及种子的催芽

将供试菌株分别接种到克氏瓶中YMA培养基平面上，28℃培养36h，用大约100mL无菌水洗下菌体，装入无菌三角瓶中，旋涡振荡打散菌体后,取一部分测其OD值 (600 nm)，使每毫升菌悬液中根瘤菌数量达20亿个。苜蓿种子经95%乙醇处理15min，用无菌水冲洗5～8次，再用0.1%的HgCl进行表面消毒4min之后,用无菌水冲洗7～8次,分别用沙皿法在28℃下催芽。

1.2.2 蛭石栽培及接种

取l培养皿加入1种备用的菌悬液适量 (以淹没种子为宜)再加入发芽一致、芽长约1cm的1种苜蓿种子,浸泡15min,用无菌镊子夹取植入装有无菌蛭石的塑料杯中，每杯种植4颗，再沿各植株根部加入该菌液2 mL，使每个处理中含菌量达到40亿个,中苜l号、RS分别用10种不同根瘤菌进行接种处理，Vector、WL323分别用8种不同根瘤菌进行接种处理，各个处理设3个重复，各品种(或品系)以不接菌作为空白对照，同样设3个重复。以上操作均在无菌操作台上进行，最后转入光照强度为9000Lx，白天温度为(23±5)℃，晚上温度为(18±2)℃，日照时数16 h的温室中培养。

1.3 接种效果的测定

待植物生长到45d后进行收获。收获时把根用水洗干净，分别测定每株植物的有效根瘤数(以呈现粉红色为标准)、总根瘤数、植物地上部分干重(以第1片子叶叶痕处作为划分标准，苜蓿样品在80℃烘干到恒重后称其干重)。计算出单株的平均有效根瘤数、平均总根瘤数和地上部分平均于重，进行数据分析和处理。

2 结果与分析

我们进行了所选用的苜蓿根瘤菌菌株（11株）与我们所选用的在黑龙江省大面积栽培的苜蓿品种（巨人201，金皇后，驯鹿，肇东苜蓿，敖汉）进行最佳共生匹配的双瓶试验，试验结果见表1-5。

从表1的试验结果中可以看出，接种SM32、SM33、SM35、SM39和SM41的苜蓿植株在株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等几个考察的生物学指标中明显地优于接种其它几个菌株的苜蓿植株。

表1 苜蓿根瘤菌与巨人201苜蓿最佳共生配对试验结果Table 1 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with the Juren 201

表2 苜蓿根瘤菌与金皇后苜蓿最佳共生配对试验Table 2 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with Golden Empress alfalfa

从表2的试验结果中可以看出，接种苜蓿根瘤菌SM32、SM33、SM35、SM40 和 SM41 的苜蓿植株在株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等几个考察的生物学指标中，明显地优于接种其它几个菌株的苜蓿植株。

从表3的试验结果中可以看出，接种苜蓿根瘤菌SM32、SM35、SM38 SM341、和 SM39 的苜蓿植株在株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等几个考察的生物学指标中明显地优于接种其它几个菌株的苜蓿植株。

表3 苜蓿根瘤菌与傲寒最佳共生配对试验Table 3 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with Aohan

表4 苜蓿根瘤菌与驯鹿苜蓿最佳共生配对试验Table 4 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with reindeer alfalfa

从表4的试验结果中可以看出，接种苜蓿根瘤菌SM32、SM33、SM35、SM39 和 SM41 的苜蓿植株在株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等几个考察的生物学指标中，明显地优于接种其它几个菌株的苜蓿植株。

从表5的试验结果中可以看出，接种苜蓿根瘤菌SM32、SM35、SM39、SM40 和 SM41 的苜蓿植株在株高、叶片颜色、结瘤数、瘤干重和植株地上部分干重等几个考察的生物学指标中明显地优于接种其它几个菌株的苜蓿植株。

表5 苜蓿根瘤菌与肇东苜蓿最佳共生配对试验Table 5 Optimum symbiosis matching results of Sinorhizobium meliloti with Zhaodong alfalfa

比较5组试验数据结果，证明在供试的11个苜蓿根瘤菌菌株中，SM32、SM35 、SM39、SM41 这四株苜蓿根瘤菌与我省寒地草场中广泛栽培的具有代表性的5个苜蓿品种进行的共生匹配试验中，均表现出了良好的固氮结瘤效果，接种它们的苜蓿在株高、叶色、结瘤数和植株地上部分干重等指标上，均明显地优于接种其它的根瘤菌菌株的植株，根据上述的研究结果，我们筛选出了 SM32、SM35 、SM39、SM41 这四个与我省寒地草场中主栽的苜蓿品种最佳共生匹配的苜蓿根瘤菌菌株。

3 结 论

苜蓿作为一种适种于荒漠、干旱、贫瘠地区的先锋植物，能很好地适应我国北方寒地草场地区的自然环境。当前正在进行的退耕还林还草工程，需要大面积种植豆科灌木和牧草，接种根瘤菌是解决大面积人工林场、草场“氮素营养缺乏”问题的有效途径[13～15]。因此，研究苜蓿与根瘤菌之间的最佳共生匹配关系，使苜蓿获得最佳固氮效果，大力推广根瘤菌接种技术，不仅可以改善北方寒地草场地区的土壤微生态环境，而且还可以推动该地区的畜牧业的发展。所有根瘤菌并不能使同一苜蓿品种获得同样的接种效果，只有根瘤菌与寄主植物具有很好的匹配性，才能获得最佳的共生结瘤固氮效果。本文进行了北方寒地草场中主栽的5个紫花苜蓿品种分别接种11株不同的根瘤菌在温室条件下的最佳共生匹配试验，从中筛选出了与不同紫花苜蓿品种具有最佳结瘤固氮效果的根瘤菌，为最终用于苜蓿栽培生产，提高苜蓿产量和品质，以及豆科牧草接种根瘤菌筛选高效菌株，建立起一套行之有效的根瘤菌选种技术方法[16，17]。

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