鲢鱼蛋白质酶水解最佳工艺条件的研究

刘永乐，李向红，陈志军，王发祥，王建辉，俞 健

（长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410014）

我国是淡水资源大国，淡水鱼产量一直居世界前位。湖南省是水产大省，全省有水面136.2万hm2，内陆水域面积居全国第3位，2008年全省水产品总产量达到207.3万t，淡水鱼产量排全国第4位，渔业总产值162.9亿元，占农业总产值的6.7%，淡水鱼是仅次于水稻和生猪的大宗农产品。但目前湖南省渔业产业状况仍不容乐观，鲢鱼、草鱼、鳙鱼等较低价值鱼类基本上只能鲜销[1]，鲜销过程中腐败率达30%以上，易导致渔农经济收入减少、资源浪费和环境污染；水产品加工率低，发达国家的水产品加工率在80%以上，我国淡水鱼加工率仅5%左右，而湖南省则不足3%；而且加工深度不够，初级加工产品依然统领市场，缺少优质定型产品。因此，研发低值淡水鱼的综合利用技术，提高产品附加值势在必行。

目前，鱼类水解蛋白因其氨基酸比值与人体肌肉成分近似，而受到人们的普遍关注，酶解后的小分子多肽容易被人体消化吸收，经过加工后，鱼产品的功能和价值也得到较大的提升[2-5]。当前，人们已经开始研究低值小杂鱼及鱼杂的酶解条件[6-7]。鲢鱼作为我国四大家鱼之一，具有生长快、质量大、细刺少等特点，且饲料来源广泛，大规模养殖产量最高。但其肉质有些粗糙，口感欠佳，鲜食不太受欢迎。鲢鱼的蛋白质含量最高可达到26.6%，同时含有丰富的不饱和脂肪酸，有利于血液循环，经常食用具有抗衰老、养颜的功效，对肿瘤也有一定的预防作用[8-11]，因此，鲢鱼是水解鱼肉蛋白的佳选。试验以鲢鱼为原料，采用复合蛋白酶进行酶解，对其水解工艺的优化进行了探索，旨在为提高鲢鱼这种低值淡水鱼的综合价值提供理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲢鱼蛋白（实验室自制）；复合蛋白酶、TNBS试剂（Sigma公司）；标准牛血清白蛋白（上海泽龙生物工程有限公司）；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

紫外分光光度计（UV-2100型，上海舜宇恒平）；pH计（DELTA 320，上海天普pH计有限公司）；85-2数显恒温磁力搅拌器（天津市泰斯特仪器有限公司）；冷冻离心机（RC-6 Plus，湘仪离心机仪器有限公司）；定时恒温磁力搅拌器（90-2型，上海精科实业有限公司）；高速组织捣碎机（武汉市江汉区圣科仪器设备批发部）；岛津电子分析天平（AUY120，日本岛津公司）；真空冷冻干燥机（FD-1，北京博医康实验仪器有限公司）

1.3 方法

1.3.1 常规成分的测定 蛋白质的测定：凯氏定氮法 GB5511-85，N 为 7.24[12]；水分的测定：105℃恒重法GB5512-85；灰分的测定：干法灰化法GB5505-85。

1.3.2 酸溶碱沉法提取鱼蛋白的工艺流程 根据文献[13-15]采用酸溶碱沉法制备。

称取一定量的鱼肉绞碎，固液比1∶9加水搅拌进组织捣碎机以10 000 r/min捣碎打浆，然后用纱布过滤。滤液在4℃下用酸调节ph值至2.40并不断搅拌90 min；5 000 r/min冷冻离心15 min，取上清液，将pH值调至5.40，再次5 000 r/min冷冻离心，得到的沉淀即为提取的粗蛋白，最后将粗蛋白冷冻干燥48小时得到蛋白粉备用。

制备鱼蛋白主要工艺流程如下所示：鱼肉切碎→加水打浆→加酸搅拌均质→离心分离→上清液→碱沉→离心分离→沉淀→ 冷冻干燥→鱼肉蛋白。

1.3.3 鱼肉蛋白得率及提取率计算

1.3.4 鲢鱼蛋白酶解物的制备 按如下流程制备可溶性鱼蛋白质[16]：

鲢鱼蛋白→复合蛋白酶酶解（底物浓度3%、温度55℃、pH值7.0、时间50 min、酶浓度1%）→灭酶（100℃，10 min）→ 离心（5 000 r/min，20 min）→上清液→浓缩→冷冻干燥→可溶性鱼蛋白（鱼肽）

2 结果与分析

2.1 原料鲢鱼蛋白的基本成分

采用酸溶、等电沉降法提取鲢鱼蛋白，所制备的鲢鱼蛋白的基本组成：蛋白含量为75.24%，水分3.85%，灰分3.55，得率69.07%。

2.2 标准曲线的绘制

利用标准牛血清蛋白制作蛋白质浓度与吸光值对应关系的标准曲线，即可根据特定吸光值计算初出样品液的蛋白质浓度，所得标准曲线公式为：y=0.943 x，R2=0.998。

2.3 酶解单因素试验

以底物浓度（%）、反应时间（t，min）、反应温度（T，℃）和反应pH值为单因素，以水解液中蛋白浓度为指标分别进行考察。

2.3.1 底物浓度对酶解结果的影响 配制底物浓度分别为0.5%、1%、2%、3%、4%、5%的蛋白溶液，按 0.1%（E/S）加入酶液，在温度 55℃，pH 5.5下反应55 min，升温至90℃加热10 min终止反应，测定水解液蛋白浓度，结果如图1所示。随着底物浓度增加酶解液中蛋白浓度逐步增大，当底物浓度到2%后变化趋于平缓，可能是由于底物浓度过大出现产物抑制，故选定2%为最适底物浓度。

图1 底物浓度对酶水解鲢鱼蛋白的影响

2.3.2 反应时间对酶解结果的影响 浓度为2%的蛋白液等量分成7份，在温度55℃，pH值5.5下按0.1%（E/S）加入酶液反应。反应时间分别为15、25、35、45、55、65、75 min，结果如图 2 所示。随着反应时间的延长，产物浓度一直在逐渐增大，但在55 min之后增加趋势不再明显趋于平缓，从经济性的角度考虑，最后确定55 min为最佳的反应时间。

图2 反应时间对酶水解鲢鱼蛋白的影响

2.3.3 反应温度对酶解结果的影响 在考察最适反应温度的时候其他的条件分别固定为：反应时间为20 min，pH值为5.5，底物浓度1%。由图3可以看出从30℃到60℃反应上清液中的蛋白浓度先增加后降低，可见复合蛋白酶在催化鱼蛋白水解过程中随着反应温度的上升活性逐渐增大，增加到一定值后又开始下降是因为酶也是一种蛋白质，温度过高会导致其变性，从而酶活力下降。由于在55℃出现浓度的峰值，说明该酶的最佳反应温度为55℃。

图3 反应温度对酶水解鲢鱼蛋白的影响

2.3.4 不同pH值对水解液蛋白质浓度的影响在考察最适反应pH值时，其他的条件分别固定为：反应温度为55℃、底物浓度1%、反应时间55 min。从图4可看出，pH值对复合蛋白酶水解鲢鱼蛋白影响较显著，在pH值逐步增大的过程中酶解液中蛋白浓度先增大，在pH值7.0时达到最大值，后又迅速下降。故确定pH值7.0为适宜pH值。

图4 反应pH值对酶水解鲢鱼蛋白的影响

2.4 鱼蛋白水解条件的正交优化法

为了获得具有较高可溶性氮回收率的鱼蛋白水解物，在单因素的基础上，以反应温度、反应时间、反应液pH值和底物浓度对水解液可溶性氮回收率（Recovery）为指标，设计4因素3水平来拟合因素和指标之间的函数关系，采用正交分析法来寻求接枝最优工艺参数。试验因素的水平见表1，试验设计和结果见表2。

从极差分析结果可以看出，各因素对水解液蛋白质浓度影响的主次顺序为：C>A>B>D，即pH值>反应温度>反应时间>底物浓度。最优方案为C2A3B3D3。即鱼蛋白水解的最佳工艺参数为pH值7.0、反应温度55℃、底物浓度3%、反应时间为55 min。

表1 正交试验的因素水平表

表2 正交试验结果分析

2.5 最佳提取工艺的验证

称取鱼蛋白粉1.2 g（已经按照纯度将其折合成纯蛋白，能够达到所需浓度），加pH值7.0的磷酸盐缓冲液15 mL，后待其加热到55℃后加入0.5 mL 1%的复合蛋白酶溶液，反应55 min进行验证试验。结果如表3所示。

表3 最佳酶解工艺验证结果 （%）

3 结 论

采用酸溶碱沉法提取鱼蛋白，经测定，蛋白质含量约为75%。以蛋白质水解液的蛋白质回收率为指标，进行单因素试验确定了鱼蛋白水解的较佳工艺条件，并在单因素试验结果的基础上用正交法对酶解条件进行了优化，得到的最佳工艺条件为：反应温度为55℃，反应时间为55 min，pH值为7.0，底物浓度为3%；优化后的水解液蛋白质回收率约为50.88%。水解后鲢鱼蛋白在广泛的pH值的范围内均有较好的溶解度，其他功能性质也得到不同程度的提高。

[1]Yan S C,Li Y R,Han X D,et al.Availability test of the free phospholipids in the plasma of three species of freshwater fish[J].Agricultural Science&Technology,2010,11（2）:121-123,172.

[2]Adler-Nissen J.Enzymic Hydrolysis of Food Proteins[M].Elsevier Apphed Science Publishers.1986.25-28.

[3]褚忠志，于 新.鱼类蛋白质酶水解研究进展[J].仲恺农业技术学院学报，2007，20（3）：66-70.

[4]刘通讯，李 媛.低值鱼蛋白酰化改性与其酶解特性关系的研究[J].现代食品科技.2008，（24）：7.

[5]施文正，汪之和，鱼蛋白粉的营养评价[J].氨基酸和生物资源2006，28（1）：18-19.

[6]周燕芳，詹丽虹.鲮鱼蛋白酶解条件的研究[J].江苏农业科学.2010，（2）：311-313.

[7]李咏梅.水产品加工中蛋白酶的应用研究[J].畜牧与饲料科学，2011，32（7）：89-90.

[8]毋瑾超，汪依凡，方长富.鲢鱼降血压肽的酶解条件[J].湛江海洋大学学报，2006，26（1）：35-39.

[9]尤 娟，罗永康，沈慧星.酶法制备鲢鱼蛋白抗氧化肽研究[J].渔业现代化，2010，37（3）：42-47.

[10]Jamdar S N.Rajalakshmi V,Pednekar M D,et al.Influence of degree of hydrolysis on functional properties,antioxidant activity and ACE inhibitory activity of peanut protein hydrolysate[J].Food Chemistry，20101,（121）:178-184.

[11]孙长颢，孙秀发，凌文华.营养与食品卫生学（第6版）[M].人民卫生出版社，2007.21-23，138.

[12]鲁健章，孙丽华，周彦钢.凯氏定氮法测定鱼蛋白质含量的干扰因素分析[J].食品科学 2010，31（19）：453-456.

[13]付湘晋，许时婴，Jinmoon Kim.酸碱法提取鲢鱼蛋白脱腥及酵母脱腥机理[J].食品与生物技术学报，2008，28（1）：57-65.

[14]陈申如，张其标，倪 辉.予酸法提取鲢鱼鱼肉蛋白质技术的研究[J].海洋水产研究，2004，25（5）：61-64.

[15]常志娟.采用采用复合酶水解青鳞鱼蛋白及水解产物特性研究[D].湛江：湛江海洋大学，2005.

[16]郭浩楠，杨荣华，袁晓晴，等.鲢鱼蛋白的酶解及其酶解物功能性质的研究[J].中国食品学报，2010，10（4）：106-111.