口蹄疫病毒AsiaⅠ/HeB株不同宿主适应毒及其多克隆抗体的鉴定

郭少娟，张中旺，张永光，王永录，潘 丽，吕建亮，周 鹏

（中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室，农业部畜禽病毒学重点开放实验室，甘肃 兰州 730046）

口蹄疫是由口蹄疫病毒（foot and mouth disease virus，FMDV）引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，以宿主范围广、传染性强、传播迅速著称，因严重危害发病动物的生产性能和畜产品质量，造成巨大经济损失，极大地冲击爆发国家的国际贸易，被世界动物卫生组织（OIE）列为A类疾病。FMDV结构蛋白构成病毒衣壳，识别特异性细胞受体，决定宿主范围和组织嗜性，决定病毒抗原性等功能。结构蛋白P1是主要的免疫保护性蛋白，通过原核表达P1蛋白，纯化后免疫动物制备多克隆血清，是一种研究结构蛋白P1功能的有效工具。FMDV是单股RNA病毒，具有高频率的核苷酸替代特性。FMDV的各种适应毒的获得是进一步研究此毒特性、应用的基础，所以对适应毒变异的鉴定是必要的[1]。研究对表达P1蛋白制备的多克隆兔抗及AsiaⅠ/HeB株FMDV在试验动物和细胞上适应后是否变异进行了鉴定。

1 材料与方法

1.1 病毒及主要试剂

FMDV HeB株由国家口蹄疫参考实验室毒种保藏中心提供，BHK-21细胞株由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室提供，RNeasy Mini Kit（Qiagen公司），Prime－Script＠ One Step RT-PCR Kit Ver 3.0（大连宝生物公司），胶回收试剂盒Wizard＠SV Gel and PCR Clean-UP System（Promega公司），灭活的口蹄疫病毒抗原由兰州兽医研究所马军武老师提供。2～3日龄乳鼠，300～400 g豚鼠由兰州兽医研究所动物厂提供。重组克隆载体pGEM-P1、多克隆兔抗由中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室制备保存。

1.2 引物设计

根据GenBank中FMDV VP1基因序列及有关文献，设计了1对引物，用于FMDV HeB株的VP1基因扩增，引物由大连宝生物合成。

上游引物：5′-CACAAATGTACAGGGATGGGT-3′

下游引物：5′-GACATGTCCTCCTGCATCT-3′

1.3 病毒鉴定

FMDV HeB/MF7融化后，离心，参考RNeasy Mini Kit操作说明提取病毒基因组RNA。参考大连宝生物PrimeScript＠ One Step RT-PCR Kit Ver 3.0反转录病毒RNA，扩增产物电泳，参考Promega的Wizard＠SV Gel and PCR Clean-UP System 回收RT-PCR产物。RT-PCR产物送大连宝生物测序。测序结果数据库BLAST比对和DNAstar分析。

1.4 病毒复壮

FMDV HeB/MF7融化后，背部皮下注射2～3日龄乳鼠，每只0.2 mL。FMDV致死的乳鼠胴体用乳白液洗净，无菌滤纸吸干水分，称重。在研钵中研磨，用 MEM/EBSS（加双抗）进行 1∶4稀释，4℃过夜浸毒，4 000 r/min离心10 min，上清液接种乳鼠，方法同上。按照上述方法连续传代2次，乳鼠致死时间稳定，收集MF9代乳鼠毒，－70℃保存备用，且按病毒鉴定中的方法对MF9代乳鼠毒是否发生变异进行鉴定。

1.5 病毒细胞毒

FMDV HeB/MF9取4 mL左右，加入1/2体积的氯仿，摇荡10 min，3 000 r/min离心20 min，取上清液装入另一试管中，4℃过夜挥发氯仿后，接种已形成单层且形态正常的BHK-21细胞，37℃，5%CO2培养箱中培养，观察记录细胞病变。连续传代至致细胞病变时间稳定，将细胞毒－70℃冻存备用，标记为FMDV HeB/CF13，且按上述病毒鉴定方法对CF13代细胞毒进行鉴定。

1.6 病毒豚鼠毒

豚鼠后肢跖部皮内穿刺接种FMDV HeB/MF9，第1次接种就产生水疱，采集水疱皮，剪碎液氮研磨，MEM/EBSS（加双抗）稀释。4℃过夜浸毒，4 000 r/min离心10 min，上清液连续接种3代，－70℃保存备用，标记为 FMDV HeB/GP3，且按上述病毒鉴定方法对GP3代豚鼠毒进行鉴定。

1.7 多克隆抗体

从重组克隆载体pGEM-P1中扩增编码P1特异性蛋白的基因片段，并克隆入原核表达载体pET-28a（+）中。通过优化表达条件，诱导大肠杆菌表达P1蛋白。P1蛋白包涵体进行SDS-PAGE，凝胶上切下目的条带，透析纯化，与等体积的弗氏佐剂乳化，背部多点注射3月龄健康新西兰兔，2周后与等体积的不完全弗氏佐剂乳化进行首次加强免疫，隔1周加强免疫一次，加强免疫3次后1周经心脏大量采血，分离抗血清。健康对照组同时采血分离血清。－70℃保存备用。

1.8 多克隆抗体鉴定

用灭活的FMDV抗原进行SDS-PAGE，转膜，1×PBST配制的5%的脱酯奶粉摇床上封闭2 h，1×PBST漂洗膜3次，将PVDF膜剪成两份，分别放入用封闭液按1∶500稀释的FMDV制备的多克隆兔抗血清和健康对照组分离的血清，室温孵育1 h，用1×PBST漂洗膜，加入10 mL DAB显色液，避光显色，待出现目的条带后立即用去离子水终止反应，观察结果。

1.9 多克隆抗体效价的测定

用灭活的FMDV抗原包被96孔的聚苯乙烯ELISA反应板，间接ELISA法测定抗体效价。0.05 moL/L的碳酸盐缓冲液（pH值 9.6）稀释FMDV豚鼠抗血清至工作浓度1∶300，在ELISA板上每孔加50 μL，振荡，封膜封板，室温过夜，弃去包被液，1×PBST洗板 5～6次，拍干 ELISA 板，200 μL 5%脱酯奶粉37℃封闭2 h，洗板，然后每孔加入50 μL用1×PBST 稀释的待测多抗血清，从 1∶25 至 1∶51 200倍比稀释，同时将健康对照组分离的血清稀释成1∶500和1∶1 000做阴性对照，37℃放置l h，洗板甩干。每孔分别加入50 μL已用1×PBST稀释的山羊抗兔IgG-辣根过氧化物酶结合物（1∶300稀释），37℃放置l h，每孔分别加入50 μL新鲜配制的OPD应用液（务必加双氧水），37℃显色15 min，50 μL的浓H2SO4终止液，终止显色，立即用酶标读数仪，在492 nm波长下读取光吸收值（OD492nm值）。

2 结果与分析

2.1 病毒鉴定

提取FMDV RNA后，用设计的特异性引物进行RT-PCR扩增，琼脂糖电泳图1，可见扩增条带与预期目的基因FMDV VP1的大小相符。将扩增的基因片段胶回收纯化，测序，结果在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/中 BLAST，选择 Asia1/jiangsu/CHA/2005（EF149009），Asia1/HeB/CHA/1/2005（EF18727 4）的VP1序列DNAstar分析，结果如图2，此毒与Asia1/jiangsu/CHA和Asia1/HeB/CHA同源性达到98.7%以上。RT-PCR电泳及测序比对结果显示，国家口蹄疫参考实验室毒种保藏中心提供的HeB/MF7属口蹄疫病毒AsiaⅠ型江苏普系毒株，较其亲本毒，与AsiaⅠ/jiangsu/China/05同源性较高。

图1 FMDV AsiaⅠ/HeB/MF7 VP1扩增产物

图2 VP1序列比对结果

2.2 不同宿主适应毒的鉴定

同上述病毒鉴定中的方法相同，从传代乳鼠毒、细胞毒、豚鼠毒中提取病毒基因组，反转录病毒RNA，PCR扩增产物电泳目的条带都与预期大小相符，约886 bp（图3、图4）。目的条带回收，测序。通过DNAstar软件对测序与提供的原毒及这3种适应毒进行比对，结果如图5。

图3 乳鼠FMDV-VP1扩增产物

图4 细胞和豚鼠FMDV-VP1扩增产物

图5 VP3序列比对结果

结果表明病毒在不同的宿主传代适应后与原毒VP1基因序列同源性都大于98%。在乳鼠连传2代后VP1基因核苷酸序列同源性为98.6%，乳鼠毒在BHK-21细胞上连传13代后VP1基因核苷酸序列同源性为99.5%，乳鼠毒在豚鼠连传3代后VP1基因核苷酸序列同源性为100%。根据同一血清型口蹄疫病毒基因型划分，此3种适应毒为遗传关系高度密切的同一基因亚型。

2.3 多克隆抗体Western Blot及ELISA抗体效价

FMDV抗原SDS-PAGE电泳后，转膜，对多克隆兔抗及健康对照血清进行Western Blot。

结果如图6，P1蛋白制备的多克隆兔抗与FMDV抗原形成了特异的抗原抗体反应带。间接ELISA法测定多克隆兔抗的效价，结果判定其效价＞1∶800。

图6 抗体与FMDVAsiaⅠ标准抗原的Western blot反应

3 讨论

FMDV在流行过程中易受外界因素的影响，特别是易感动物免疫压力的影响，病毒的毒力和抗原性都易发生变异。选择压力主要作用于抗原位点因此病毒的变异也主要发生在编码这些位点的基因组序列中。不同分离株之间甚至同一毒株的不同代次之间都存在明显的核苷酸差异[1]。郑海学等[2]通过对Asia1型FMDV的1D序列分析证实，田间含有RDD毒株（RGD中的 G突变为 D）的细胞感染力和乳鼠致病力比田间含有RGD毒株的高10倍左右。郑海学等[3]对Asia1型FMDV猪源毒株和牛源毒株的全基因比较分析表明，主要差别是猪源毒株Asia1/HN/06在主要抗原位点变为RDD和155位置的N变为S或D。Martinez等[4]用同一 FMDV分离株在不同的时间结果发现产生了具有不同核苷酸序列的变异毒株。Dela Torre等[5]在 BHK-21细胞系上建立了C型FMDV的持续感染，并从中分离病毒对其基因组与其祖代毒株的基因组进行了比较分析，发现后代病毒基因组在逐渐发生变异。适应毒结构蛋白VP1序列的稳定是应用此毒对疫苗免疫效果评价可信的因素之一。

FMDV P1基因编码的结构蛋白是构成FMDV衣壳的基础，结构蛋白P1具有很好的抗原性，包含了FMDV的主要抗原位点，对诱导动物机体产生中和抗体和其他保护性免疫反应有重要作用。通过FMDV抗原对P1蛋白制备的多克隆兔抗的鉴定是下一步应用此多抗的基础。Sanz P A等[6]在P1重组腺病毒免疫牛可部分保护口蹄疫感染之后，用P1重组腺病毒及P1重组痘病毒免疫猪也获得了免疫保护。牟伟锋等[7]用构建的含有AsiaⅠ型FMDV衣壳蛋白前体P1-2A基因的真核表达质粒免疫小鼠，诱导产生了特异性的体液免疫和细胞免疫应答。张中旺等[8]应用P1制备的多克隆血清筛选结构蛋白上预测的B细胞表位。

本研究对AsiaⅠ/HeB株FMDV在实验动物乳鼠，豚鼠和FMDV培养常用细胞BHK-21获得的适应毒应用RT－PCR技术扩增VP1基因，测序比对确定其核酸序列同源性高达98%以上，主要抗原位点未发生变异，可进一步应用到疫苗研究中。并应用Western blot对表达的结构蛋白P1制备的多克隆兔体进行了鉴定，确定此多抗能中和FMDV结构蛋白，间接ELISA方法确定了抗体效价＞1∶800。

[1]谢庆阁.口蹄疫[M].北京：中国农业出版社，2004.20-30，39-49.

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[3]郑海学，靳 野，倘佑军，等.口蹄疫病毒第V群猪源和牛源毒株全基因组比较分析[J].微生物学通报，2010，37（9）：1312－1319.

[4]Martínez,M A,Mateu,M G,Capucci,L A,et al.single amino acid substitution affects multiple overlapping epitopes in the major antigenic site of foot-and-mouth disease virus of serotype C[J].Journal Gen Viro,1990,72（3）:629-637.

[5]Dela Torre J C,Martínez-Salas E,Diez J，et al.Coevolution of cells and viruses in a persistent infection of foot-and-mouth disease virus in cell culture[J].J.Virol.，1988，62（6）:2050-2058

[6]Sanz P A,V azquez B,Sobrino F,et al.Evidence of partial protection against foot-and-mouth disease in cattle immunized with a recombinantadenovirusvectorexpressing the precursor polypeptide（P1）of foot-and-mouth disease virus capsid proteins[J].J.Gen Virol 1999,80（3）:671-679.

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