不同牛奶消费量对雄性ICR小鼠生殖系统的影响

高强 刘建 石剑 贾中骄 马玉霞

动物性食品中含有相当数量雌性激素，如雌激素和黄体酮［1］等，随着人们生活质量的提高，动物性食品的消费量也在逐渐增加，导致雌激素摄入量的增加，从而使和雌激素相关的疾病发病率增加，如男性前列腺癌和睾丸癌等;同时男性的生殖质量在全世界范围下降［2］，包括精子数量下降、隐睾和睾丸不降的上升等，也均与环境激素有关。研究表明，人类食物中雌激素的70% ～80%来自牛奶［3］，本研究以小鼠为研究对象，以了解牛奶是否对实验动物的生殖系统产生影响。

1 材料与方法

1.1 动物分组 22 d龄ICR小鼠(购于北京维通利华实验动物技术有限公司)96只，雌雄各半，称重编号，随机将实验动物分为4组:5 ml牛奶组，10 ml牛奶组，15 ml牛奶组，对照组。置于(24±2)℃的恒温动物房内。

1.2 给饲方法 雌雄分笼饲养，6只一笼。4组实验动物给与基础饲料(购于河北医科大学实验动物中心)，自由摄食。同时给予清洁卫生的城市自来水，自由饮用。除基础饲料外，5 ml牛奶组，10 m l牛奶组，15 ml牛奶组分别按照 5 ml/只、10 ml/只、15 ml/只的剂量给予牛奶(市售某品牌)，给饲方式为自由饮用。

1.3 一般观察 除每天观察小鼠行为、外观变化外，每周进行一次体重称量，经过牛奶饲喂12周后，同组别小鼠以雌雄1∶1的比例同笼，同笼时间为6 d。每天观察并记录雌鼠阴栓情况，没有观察到阴栓的雌鼠如怀孕也被记作交配成功，计算交配率。在雌雄小鼠同笼6 d后，无论是否发现阴栓，均将雄鼠和雌鼠分开，雌鼠继续喂养，观察怀孕率。交配率(%)=发现阴栓或怀孕的雌鼠数量/和雄鼠同笼的雌鼠数量×100%怀孕率(%)=怀孕的雌鼠数量/发现阴栓的雌鼠数量×100%。

1.4 小鼠血清中激素检测 同笼结束后，雄鼠采用乙醚麻醉，股动脉取血，采用放射免疫分析法检测实验动物血清中雌二醇、雌三醇、睾酮含量。

1.5 生殖器官观察 分离精囊腺、附睾、睾丸，采用1/10 000电子分析天平称量湿重并录入计算机分析。

1.6 精子计数 称重后，将左侧附睾置于已加入5m l0.9%氯化钠溶液的4 cm平皿中，用眼科剪将附睾均匀剪为6段，置于37℃温箱中温育5 min。温育过程完毕后在平皿中取50μl悬浮液滴入血细胞计数板，置于显微镜下记录镜下4个大方格内精子数。精子计数计算公式为N=M×4×L/0.0001×W。N:每克附睾组织中的精子数;M:平均每个大方格中的精子数。L:液体体积;0.0001:计数池总体积(ml);W:附睾重量(g)

1.7 组织学观察 生殖器官称重后，用10%甲醛固定标本24 h后，序列酒精脱水，石蜡包埋切片，HE染色，制成光镜病理片。

1.8 统计学分析 应用SPSS 13.0统计软件，对生殖系统器官重量进行多个均数比较的方差分析，方差不齐时采用多个独立样本非参数检验。食物消费量与体重变化采用重复测量设计资料的方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物的一般情况及体重 实验过程中ICR小鼠生长状况良好，活动正常，在整个实验过程中未见死亡。雄鼠5 m l牛奶组、10 ml牛奶组的体重增长较快，与对照组相比，差异有统计学意义(P＜0.05);15 ml牛奶组、对照组之间及5 m l牛奶组、10 m l牛奶组、15 ml牛奶组之间的体重增长差异无统计学意义(P ＞0.05)。见图1。

图1 体重变化

2.2 雄性ICR小鼠生殖器官湿重与相对重量 牛奶3组的雄性ICR小鼠附睾和精囊腺湿重均低于对照组，但几组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。牛奶3组睾丸、附睾、精囊腺的相对重量均低于对照组，但差异差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 4组生殖器官重量比较n=12，±s

表1 4组生殖器官重量比较n=12，±s

相对重量(g/kg)组别 附睾 睾丸 精囊腺5 m l牛奶组 91.35 ±14.58 0.25 ± 0.05 0.19 ± 0.06 2.27 ±0.37 6绝对重量附睾(mg) 睾丸(g) 精囊腺(g).53 ±1.17 5.96 ±2.22.13 ±1.25 4.66 ±1.42 10 ml牛奶组 84.72 ±16.45 0.25 ± 0.05 0.21 ± 0.06 2.13 ±0.39 6.23 ±1.34 5.29 ±1.43 15 ml牛奶组 88.67 ± 15.34 0.26 ± 0.06 0.23 ± 0.05 2.18 ±0.32 6.38 ±1.34 5.67 ±1.54对照组 95.89 ± 32.32 0.26 ± 0.05 0.24 ± 0.09 2.38 ±0.61 6

2.3 精子计数 雄性ICR小鼠精子计数结果，牛奶3组和对照组之间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 4组精子计数比较n=12，±s

表2 4组精子计数比较n=12，±s

精子计数组别5 m l牛奶组20±11 10 ml牛奶组 16±10 15 ml牛奶组 19±10对照组15±8

2.4 血清中激素水平检测 5 m l牛奶组、10 m l牛奶组、15 ml牛奶组雄性ICR小鼠血清中雌二醇含量均高于对照组，且有剂量反应关系，牛奶量摄入量越高，雌二醇含量越高;而血清中雌三醇的含量均低于对照组，睾酮含量均高于对照组，差异均无统计学意义(P ＞0.05)。见表3。

表3 4组激素水平比较n=6，±s

表3 4组激素水平比较n=6，±s

组别 雌二醇(pg/m l) 雌三醇(ng/m l) 睾酮(ng/dl)5 m l牛奶组2.2 ±1.6 20 ±5 1 436 ±1 765 2.9 ±1.0 16 ±5 1 542 ±717 10ml牛奶组 3.0±1.9 16±6 1 555±1 324 15 ml牛奶组 3.8±0.8 18±3 1 746±1 496对照组

2.5 交配率与怀孕率 5 ml牛奶组、10 ml牛奶组、15 ml牛奶组和对照组之间的交配率与怀孕率差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 4。

2.6 组织学观察 光镜下未发现睾丸精管内生精细胞有脱落、坏死、变质等明显的病理改变，睾丸间质内未见有出血、水肿、增生、炎症细胞浸润等。高倍镜下精原细胞、精母细胞、精细胞界线清楚、细胞形态完整，间质细胞形态正常。附睾输出小管和附睾管上皮细胞形态完整，基膜明显。

表4 4组交配率与怀孕率比较 n=12，例(%)

3 讨论

近年来，世界范围内出现了男性生育质量下降和生殖系统疾病发病率上升的现象，这些问题被认为与“环境雌激素”有关。环境雌激素主要通过水、空气、食物作用于人体，其中食物是一个将环境雌激素暴露于人体的重要途径。在东西方膳食结构与生殖系统健康的相关研究中，相当多的流行病学结果提示生殖系统发病率与动物性食品中牛奶有关。西方国家过去50年睾丸癌发病率的增加，被认为可能与牛奶及乳制品的消费量有关。在英国进行的一项病例对照调查发现，患有睾丸癌患者少年期牛奶的消费量明显高于对照人群［4］。Qin等［5］分析了大量的文献后提出牛奶及乳制品中的雌激素可能为前列腺癌发生的诱因之一。还有相应的研究显示，现在商业化牛奶与之前的牛奶相比，其中的雌激素的含量有上升的趋势［6，7］。为此，我们进行了一项牛奶对ICR雄性小鼠生殖系统影响的研究。

实验中发现，在实验动物在总热能摄入无明显差异的情况下，5 ml、10 ml牛奶组的雄鼠体重增长较快，自第7周开始持续到最终，与对照组相比差异有统计学意义。15 m l组每周体重增长均数高于对照组，但无明显差异。这与本课题组在日本进行一项关于牛奶对ICR小鼠生殖能力影响的一代交叉繁殖实验结果相符［8］。在生殖器官的湿中与相对重量的比较中可以观察到，经牛奶干预的雄性ICR小鼠生殖器官重量普遍偏轻，但无统计学差异。能够反映生殖能力的精子计数、交配率、生育率也未见异常。但本课题组在另一项实验中曾发现在亲代小鼠均为牛奶饲喂的情况下，有2只雌鼠仅产仔6只［8］。推测其原因有可能是牛奶种类不同导致的，已有报导证实，不同品种奶牛或者不同喂养方式所生产的牛奶［7，9，10］，在雌激素含量水平上存在一定的差异。

血清激素水平检测未见阳性结果，但就检测数据来看，不同剂量牛奶干预后的雄性ICR小鼠血清中雌二醇水平均高于对照组，且存在剂量反应关系。有研究报导，牛奶中的雌激素水平可以影响到人体雌激素的代谢［11，12］。雌二醇主要作用于下丘脑，如果人体获得的雌激素过多将会打破下丘脑—垂体—睾丸轴，从而对成年后睾丸的大小和精子数量产生影响，并有可能影响精子的质量［13］，并可干扰睾丸的下降［14］。

本次实验没有发现不同量牛奶的消费对ICR小鼠的生殖系统和生育能力有明显的影响，但就目前的研究资料，还不能够排除牛奶具有降低生育能力作用，尚需进一步研究。

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5 Qin LQ，Wang PY，Kaneko T，et al.Estrogen:one of the risk factors in milk for prostate cancer.Med Hypotheses，2004，62:133-142.

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7 袁丽君，徐庄剑，胡瑜，等.部分牛奶中雌二醇和孕酮的含量分析.中国食品卫生杂志，，2007，19:139-141.

8 Yu －Xia MA，Naoyuki EBINE，Kazuo AKOI.Effectsof Cow’sMilk on reproduction in ICR Male Mice.Biomedical And Environmental Sciences，2002，22:161-163.

9 李湘鸣，刘秀梵.牛奶中雌性激素样物质对雄性大鼠生殖腺的影响.卫生毒理学杂志，2003，17:97-100.

10 周虹，王燕，王培玉.市场牛奶和传统牛奶对乳腺癌发生影响的研究.中华肿瘤防治杂志，2008，15:1536-1539.

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12 Bernstin L，Ross RK.Endogenous horm ones and breast cancer risk.Ep idem iol Rev，1993，15:48-65.

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14 Charles G，Crispens JR.Handbook on The Laboratory Mouse.Charles C Thomas Publisher，Springfield Illinois，USA，1975，116:296-299.