高效液相色谱法测定不同加工方法白芍中芍药苷的含量

张海先，刘海萍，曾锐

白芍是毛茛科植物芍药Paeonia lactiflora Pall．的干燥根，夏、秋两季采挖，洗净后除去头尾及细根，置沸水中煮后除去外皮或去外皮后再煮，晒干。苦、酸，微寒，具有平肝止痛，敛阴止汗等功效[1~3]。芍药苷是白芍的主要有效成分，具有降低血压、护肝、镇痛等作用[2~3]。四川中江和安微亳州历来为白芍的道地产区。《药物出产辩》（1931）中记载：“白芍产四川中江、渠县为川芍，产安徽亳州为亳芍。” 目前大量文献报道市售白芍商品中芍药苷含量多低于药典规定[4~9]；另有研究发现产地加工方法的不同对芍药苷含量的影响比较大，从而直接影响白芍的质量[3,10]。本实验采用高效液相色谱法测定川芍和亳芍中芍药苷的含量，比较白芍鲜药、阴干、水煮后去皮晒干样品的内在质量，为建立白芍最佳产地加工方法提供一定的参考依据。

1 仪器与试药

Waters 2695高效液相色谱系统，配四元梯度泵，真空脱气机，自动进样器，Waters 2996型PAD检测器，Empower色谱工作站； KQ5200E型超声波清洗器（功率200 W，频率40 kHz，昆山市超声仪器有限公司）；METTLER AE240型电子分析天平（中国瑞士梅特勒公司）。芍药苷对照品购自中国药品生物制品检定所（批号：110736-200934，纯度95.7%）；乙腈 (色谱纯)，甲醇(色谱纯)，乐百氏纯净水（过0.45 μm滤膜），其他试剂均为分析纯。

本实验用新鲜和水煮后去皮晒干的白芍药材分别收集于四川中江县逢春制药白芍GAP种植基地和安徽亳州白芍药材种植基地；因四川中江大量阴干白芍出口日本，故同时收集四川中江阴干白芍药材进行实验；白芍药材的生长年限均为 4年。经西南民族大学民族医药研究院刘圆教授鉴定为毛茛科植物芍药Paeonia lactif l ora Pall．的根。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱为Diamonsil C18柱(5 μm，250 mm×4.6 mm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸(14:86)；检测波长230 nm；柱温 30 ℃；流速 1 mL·min-1；进样量10 μL，规定理论塔板数按芍药苷峰计算不低于2000。高效液相色谱图见图1。

图1 白芍对照品和供试品HPLC图

2.2 对照品溶液的制备

取芍药苷对照品2.9 mg，精密称定后置25 mL量瓶中，用甲醇溶液溶解并定容至刻度，摇匀后备用。

2.3 供试品溶液的制备

取白芍药材中粉约0.1 g，精密称定后置于50 mL量瓶中，加入稀乙醇35 mL溶解，称定质量后超声处理（功率240 W，频率45 kHz）30 min，放冷后稀乙醇补足重量，定容，摇匀并用0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.4 方法学考察

2.4.1 线性关系考察 取上述芍药苷对照品溶液，分别进样5 μL，15 μL，18 μL，20 μL，25 μL测定峰面积，以含量为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归分析，绘制标准曲线，线性范围为0.555μg ~2.78μg，得回归方程为 Y = 7×10-7X - 0.0045，相关系数r =0.9998。

2.4.2 精密度试验 取“2.2”项下的芍药苷对照品溶液（0.111 mg·mL-1）10 μL，按上述色谱条件连续进样6次，记录色谱图，测定芍药苷峰面积积分值，RSD为0.99%，说明进样精密度良好。

2.4.3 稳定性试验 取同一芍药供试品溶液（川白芍鲜药），配制后室温放置，在0，4，8，12，24，48 h注入高效液相色谱仪，依法测定峰面积， RSD 为1.03%，表明本实验芍药供试品在48 h内稳定。

2.4.4 重复性试验 精密称取同一白芍样品（川白芍鲜药）6份，每份0.05 g，按“2.3”项制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别测定芍药苷的含量，RSD为0.92%，表明重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验 精密量取已知芍药苷含量的白芍样品（川白芍鲜药）6份，每份0.05 g，分别精密加入芍药苷对照品溶液，各进样10 μL测定峰面积，计算加样回收率，平均回收率为97.15%；RSD为1.53%，表明本方法准确度较好。

2.5 样品含量测定

将5份白芍样品按“2.3”项制备，取10 μL供试品溶液注入液相色谱仪，按上述色谱条件测定，记录色谱图并用外标法计算各样品芍药苷含量，数据分析采用SPSS19.0 软件进行差异显著性检验（LSD法），结果见表 1。

表1 不同产地加工方法白芍药材芍药苷含量测定结果（n=3）

3 讨论

由实验结果可以看出，四川中江：鲜药＞阴干＞水煮后去皮晒干，鲜药和阴干法对水煮后去皮晒干法具有统计学意义；安徽亳州：鲜药＞水煮后去皮晒干，鲜药对水煮后去皮晒干法具有统计学意义。分析原因可能是由于芍药苷易溶于水，水煮过程极易造成芍药苷流失[3]；白芍药材除主要含有芍药苷外，还有芍药内酯苷、没食子酸、苯甲酸、儿茶素等成分[11~13]，有作者认为这与中药自身成分的复杂性有关，不同来源的样品中化学成分的比例不同[14]，不同加工方法是否造成白芍中化学成分比例的改变，需进行多成分同时含量测定并结合药效学实验进一步深入探讨。

水煮后去皮晒干的白芍药材，川白芍含量明显大于亳白芍，笔者在药材基地实地考察过程中发现亳州当地农户加工白芍时，水煮时间比较随意且较长，是造成芍药苷较大损失的主因，建议应当对白芍的产地加工进行规范以保证白芍药材质量。本研究为制订白芍药材规范的产地加工方法提供参考。

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