13号染色体缺失与多发性骨髓瘤预后相关性的研究

徐洪伟，贺 飞

（哈尔滨医科大学附属第二医院 检验科，黑龙江 哈尔滨150086）

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是以浆细胞异常增生为特征的一种恶性肿瘤疾病，占血液系统肿瘤的10%、全身恶性肿瘤的1%［1］。好发于中老年人，近年来由于我国人口老龄化及人们对该病的认识水平提高，该病发病率有逐渐增加趋势。染色体异常是MM预后的重要指标，而常规染色体G显带技术操作繁琐，周期长，干扰因素多，准确性和特异性欠佳，只有约3%的患者检测结果为阳性，对治疗反应的判断及微小残留病灶的检测较为困难。随着荧光原位杂交技术（fluorescence in situ hybridization，FISH）、比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）、光谱核型分析（spectral karyotyping，SKY）等细胞遗传学和分子生物学技术的发展，MM细胞遗传学研究领域有较大进展。本研究采用I－FISH 技术，应用D13S319特异性探针，探讨 MM患者的细胞遗传学异常与临床特征的关系。

1 材料和方法

1．1 标本收集 2005－2009年我院确MM诊病例64例，男44例，女20例，年龄34－85岁，中位年龄62岁；符合国内MM的诊断标准［2］，确诊前均未接受过化疗和其他特殊治疗。I－FISH对照组选用同期10例非血液系统恶性疾病核型正常患者。

1．2 实验方法

1．2．1 免疫固定电泳采用美国Helena公司全自动快速电泳分析系统（Rapid Eleetrophoresis，REP），重链IgG、IgA、IgM和轻链κ、λ进行免疫电泳后，与相应抗体形成复合物被固定，然后进行染色、洗脱、扫描等。

1．2．2 免疫球蛋白定量采用美国 Beckman－Cou1ter IMMAGE免疫化学分析仪，以速率散射比浊法定量测定。

1．2．3 试剂 免疫固定电泳均用Helena公司生产的试剂盒。免疫球蛋白定量使用美国Beckman－Coulter公司生产的试剂盒。

1．2．4 常规核型分析 取肝素抗凝骨髓，先行有核细胞计数，以1×106－2×106／ml的密度注入10ml培养液，加有丝分裂原刺激剂PHA72小时，于终止培养前2－4小时加入秋水仙素终止中期分裂相后常规染色体标本制备。制备的染色体标本保存于－20℃，采用气干法滴片，Giemsa液染色，在显微镜下观察50个中期分裂相，核型描述依据《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN1995）》。

1．2．5 间期荧光原位杂交（interphase fluorescence in situ hybridization，I－FISH）探针 检测探针为针对13q14缺失的探针（D13S319），购自基因有限公司。（1）玻片制备：骨髓细胞悬液气干法滴片，在室温下过夜老化；将玻片在37℃新鲜配制的RNase A溶液中孵育30min，室温放置30min；室温下于2×SSC（pH7．0）溶液中漂洗玻片2次，依次置于室温的70%、85%和100%乙醇中梯度脱水，自然干燥玻片。（2）变性杂交：玻片在74℃ 变性液（70%甲酰胺／2×SSC）中变性5min后在乙醇中梯度脱水，自然干燥；置于46℃烤片机上等待杂交；将10μl探针混合物（按照探针∶去离子水∶杂交缓冲液为2∶1∶7的比例混合）于74℃水浴中变性5min，46℃水浴10－15min后滴于玻片杂交区域，立即加盖盖玻片，用橡皮胶封边；将玻片置于预热的湿盒中，42℃温箱中过夜杂交。（3）玻片洗涤：移去盖玻片，置于65℃0．4×SSC／0．3%NP－40 洗涤液中洗涤 2 min，在室温0．1%NP－40／2×SSC洗液洗涤1min，取出后暗处自然干燥，（4）荧光显微镜观察：每份标本加10μl DAPI复染，用盖玻片封好后置于暗盒中10－20min后，用荧光显微镜观察间期细胞荧光杂交信号数目。每个探针计数200个细胞，用Isis－FISH图像软件采集图像。

1．2．6 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）检测 采空腹静脉血，分离取血清，应用BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自动生物化学分析系统，速率法340nm测定LDH活性，＞250U为异常。

1．2．7 β2微球蛋白（β2－microglobulin，β2－MG）检测应用Hitarchi全自动免疫分析系统，免疫比浊法测定β2－MG含量。

1．2．8 白蛋白检测（albumin，ALB）采静脉血，分离心血清，应用BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自动生物化学分析系统，溴甲酚绿法测定。

1．2．9 血肌酐（Creatinine，CRE）检测 采静脉血，分离血清，应用 BECKCOULTER SYNCHRON CX9全自动生物化学分析系统，苦味酸法测定。

1．3 统计学方法

数据以均数±标准差（¯x±s）表示，应用SPSS17．0统计软件采用χ2、Fisher’s确切概率法检验分析MM患者中13号染色体缺失与13号染色体正常组之间 LDH、Creatinine、β2－MG、ALB的差异。应用Kaplan－Meier方法绘制生存曲线。用Cox回归模型进行单因素及多因素分析，找出影响总体生存的预后因素。P＜0．05视为有统计学意义

2 结果

2．1 64例MM患者一般资料 见表1。

表1 例64MM患者临床特征

2．2 常规染色体核型分析及I－FISH检测结果64例MM患者进行常规染色体核型8例（13%）未收获淋巴细胞，56例获得中期分裂相，其中13号染色体缺失28例（44%）（见表1）。传统核型分析中8例异常，其中13q－2例（与I－FISH结果一致），亚二倍体2例，t（11；14）（q13；q32）1例，7q－2例，超二倍体1例。

2．3 13号染色体缺失与13号染色体正常组生存差异与相关因素分析 将13号染色体缺失与13号染色体正常两组患者采用 Kaplan－Meier法评估生存曲线，13号染色体正常组患者生存时间长 （P＝0．036）。将可能影响生存的因素如性别、年龄、白蛋白等进行Cox逐步回归分析，结果显示在排除β2－MG、Creatinine、白蛋白、血红蛋白的影响条件下，13号染色体完整性是影响生存时间的独立因素，13号染色体正常组患者生存时间长（见图1）。在排除13号染色体的影响后，β2－MG对生存时间有影响，β2－MG值越高，生存时间越短，低β2－MG患者的死亡风险降低了59．82% （95%C I：0．14～0．59，P＝0．041）。13号染色体缺失与13号染色体正常两组患者在疾病进展方面存在显著差异（P＝0．042）。

图1 13号染色体缺失与正常组患者生存曲线

3 讨论

多发性骨髓瘤是恶性浆细胞病中最常见的一种类型，又称骨髓瘤、浆细胞骨髓瘤，其病理机制尚未阐明，预后与 MM患者的血红蛋白、肌酐、Ca2＋和M蛋白、免疫分型及骨髓浆细胞数密切相关。

常规染色体G显带技术由于骨髓浆细胞在体外的有丝分裂指数低下而受到限制，即使获得足够的中期分裂相，有些染色体异常仍然检测不到，通常只有1／6左右的患者核型分析结果阳性。常规染色体G显带技术可以检测到的染色体异常通常为10－12Mb大小。I－FISH 技术通过检测DNA探针与MM患者染色体异常所在靶区域的特异性结合（通常20－50Kb），对于染色体数目异常检测的敏感性明显优于常规染色体G显带技术［3］，且同时适用于分裂期和间期细胞，可以鉴别出很小的突变区域［4］。几乎所有的 MM患者均存在染色体异常，且多为复杂核型异常，其中以涉及1、14号染色体结构异常和13号染色体的全部或部分缺失最为常见［5，6］。13号染色体缺失在浆细胞疾病中较为普遍，且存在于 MM 的各个阶段，未见于正常人［5］。不同研究结果显示 MM患者中13号染色体缺失发生率约26%－50%［5，3，7］。13号染色体缺失的最小缺失区仍未精确定位。目前认为，染色体13缺失的致病主要经由以下两个途径：（1）特定基因的单倍基因功能不全（例 GTF2F2，TSC－22和 RB1等）；（2）细胞周期基因的扩增表达（例CCNB1，UBE2C等）［8，9］。其他与13号染色体缺失相关的分子水平改变还有：DNA修复缺陷、IGF1－IGF1R自分泌生长信号转导环路形成等，可能在发病过程中也具有重要作用［8］。对13号染色体缺失分子水平改变进行深入研究，将为MM患者提供新的治疗靶点。

本研究显示，64例初诊 MM患者中28例（44%）13号染色体缺失，并且与β2－MG水平升高呈正相关，提示细胞遗传学异常与MM患者的肾功能衰竭等临床特征有内在联系。13号染色体缺失组患者生存时间缩短，提示13号染色体缺失与MM的疾病进展、侵袭性病程、生存期缩短及预后关系密切。13号染色体缺失可以为MM的评估预后提供可靠依据。

综上所述，13号染色体缺失在 MM的发生、发展中可能起重要的作用，13号染色体缺失检测可用于MM患者的临床状态、疗效监测和预后判断。

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