北沙参对小鼠免疫功能的影响研究

李建业，刘运周，张 薇，王超要，胡卫红

（中国人民解放军第四二一医院 检验输血科，广东 广州510318）

北沙参为常用中药，2010版《中华人民共和国药典》收载为伞形科植物珊瑚菜Glehnia littoralis Fr．Schmidt ex Miq．的干燥根［1］，其化学成分丰富，类型复杂，具有镇咳祛痰、抗菌、抗癌和滋阴补虚等药理作用［2］。目前对北沙参的相关研究主要集中在栽培种植技术和化学成分鉴定分离分析等方面［3－4］，但对北沙参化学成分的药理活性及两者之间的关联方面缺乏深入的研究，因此，我们通过对北沙参进行深入的化学成分及药理活性研究，希望能寻找其具有相关疗效的有效成分，从而使北沙参更好地发挥其药用价值。

1 材料和方法

1．1 材料

动物：Balb／c小鼠，18－22g，雌雄各半，均由本院实验动物中心提供。药品及器材：细胞培养基RPMI 1640、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）购自杭州四季青公司；CCK－8试剂盒：日本同仁化学研究所，CK04；不锈钢细胞筛、手术刀、解剖剪、解剖镊、止血钳等手术器械（均需经消毒处理）购自晶普医疗器械有限公司；注射器、烧杯、PBS（自配，高压蒸汽灭菌后使用）和环磷酰胺（江苏恒瑞医药股份有限公司，批号008526）；北沙参（自制成不同浓度，至4℃下保存备用）。

1．2 方法

1．2．1 动物分组及给药 取50只Balb／c小鼠随机分为5组：阴性对照组（生理盐水）、阳性对照组（环磷酰胺）、北沙参1g·kg－1组、北沙参2．0g·kg－1组和北沙参4．0g·kg－1组，每组10只动物。北沙参各剂量组每天0．2ml灌胃给药1次，连续给药10d。阳性对照组以100mg·kg－1剂量给动物腹腔注射环磷酰胺1次。

1．2．2 脏器指数的计算 分组及给药见1．2．1。于末次给药24h后，称量各组小鼠体重，脱颈椎处死小鼠，迅速取出完整脾脏和胸腺，修去脂肪、系膜，用滤纸吸干脏器表面血污，称重，计算脏器指数。胸腺（脾）指数＝胸腺（脾）重 （mg）／体重（g）。

1．2．3 小鼠腹腔巨噬细胞的制备［5］颈椎脱臼法处死小鼠，70%乙醇浸泡5min；预冷PBS注射，使注入的液体散布于整个腹腔；腹膜上剪开一小口，迅速用注射器通过开口插入腹腔内吸出细胞悬液。

巨噬细胞的纯化：细胞悬液离心10min后弃上清，培养液重悬细胞，放入CO2培养箱中2h。取出培养瓶，除去未贴壁的细胞。瓶中已贴壁的细胞主要是巨噬细胞，继续培养24h后换液，得到接近纯净的巨噬细胞。

北沙参对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红能力的测定：将从上述各组小鼠腹腔分离纯化后的巨噬细胞置于CO2的培养箱中培养24h，弃上清，每孔加入0．1%的中性红溶液，CO2培养箱中继续培养4 h，取出，弃中性红。PBS清洗96孔培养板3次，弃上清。加入细胞裂解液，静置过夜，570nm波长下测定OD值（630nm为校正波长）。

1．2．4 小鼠脾淋巴细胞的制备［6］脾淋巴细胞的获取：颈椎脱臼法处死小鼠，70%乙醇浸泡5min，剪开小鼠胸腔，取出脾脏置于培养皿中，Hank’s液漂洗。粗剪脾脏成小块，置80目不锈钢筛网上，轻轻挤压，收集滤过的细胞悬液，加入消化缓存液除去血红细胞。将上述收集到的脾脏细胞置于含培养基的玻璃培养皿中，于CO2培养箱中静止培养2h，除去贴壁细胞，收集未贴壁的细胞悬液即获得接近纯化的脾脏淋巴细胞，计数接种培养。

北沙参对小鼠脾淋巴细胞杀瘤活性的影响（CCK－8法）［7］：取事先配好的靶细胞悬液加入96孔板，于CO2培养箱中静止培养2h。之后取1．2．1中不同处理组的小鼠脾淋巴细胞加入96孔板，按效靶比20∶1加入，于CO2培养箱中培养48h后加入10μl CCK－8溶液。培养4h，测定波长450nm，校正波长600nm，计算杀伤率，公式如下：

1．2．5 小鼠自然杀伤细胞的制备［8］小鼠脾脏NK细胞的获得：颈椎脱臼法处死小鼠，70%乙醇浸湿小鼠全身。超净工作台内取出脾脏置于不含血清的RPMI 1640培养液中，100目不锈钢筛网上研磨至单个细胞，200目不锈钢筛网过滤后，离心5min。弃上清，加入消化缓存液以除去血红细胞。加入0．4ml生理盐水，离心5min，细胞沉淀重悬于培养液中，调整细胞浓度。取事先配好的靶细胞悬液加入96孔板，于CO2培养箱中静止培养2h后加入NK细胞，CO2培养箱中静止培养过夜。弃上清，轻洗每孔3次，加入0．1%的中性红溶液，37℃，30 min。弃染液，轻洗每孔3次，加入细胞溶解液，492 nm测定吸光度值，公式如下：

1．3 统计学处理

使用EXCEL软件进行数据处理，所有实验数据均以均数±标准差（¯x±s）表示，t－test及三组以上（单因素 One－way）或者两组之间（两因素 Twoway）方差分析进行统计学分析，P＜0．05为具有显著性差异。

2 结果

2．1 北沙参对小鼠免疫器官重量的影响

与正常对照组相比，环磷酰胺组小鼠脾脏、胸腺重量显著降低；与环磷酰胺 组相比，北沙参组小鼠胸腺、脾脏重量明显高于环磷酰胺组，见表1。

表1 北沙参对小鼠免疫器官重量的影响（¯x±s，n＝10）

2．2 北沙参对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响

小鼠连续灌胃给予不同浓度的北沙参溶液，巨噬细胞吞噬中性红的能力见表2，在低、中、高剂量组北沙参可以增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力。

表2 北沙参对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响（¯x±s，n＝10）

2．3 北沙参对小鼠淋巴细胞抑瘤活性的影响

北沙参1g·kg－1、2g·kg－1和4g·kg－1对小鼠淋巴细胞的杀瘤率分别为20．76%、28．47%和36．61%，见表3。

表3 北沙参对小鼠脾淋巴细胞杀瘤活性的影响（x¯±s，n＝10）

2．4 北沙参对小鼠脾脏NK细胞杀伤能力的影响

北沙参1g·kg－1、2g·kg－1和4g·kg－1对小鼠自然杀伤细胞的杀伤率分别为20．58%、27．64%和38．37%，结果见表4。

表4 北沙参对小鼠脾脏自然杀伤（NK）细胞的影响（¯x±s，n＝10）

3 讨论

北沙参含有挥发油、香豆素、淀粉、生物碱、三萜酸、豆甾醇、各甾醇，沙参素等成分，可增强正气，减少疾病，预防癌症的产生［10］。

作为机体重要免疫器官的胸腺和脾脏，其脏器系数是衡量机体免疫功能的初步指标。单核巨噬细胞系统中高度分化、成熟的细胞类型—巨噬细胞，其由血液中单核细胞迁入组织后分化而成，在固有免疫中发挥防御功能，也是参与适应性免疫的专职抗原提呈细胞。单核巨噬细胞的吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的标志之一，当细菌、异物等抗原性物质进入机体后，可迅速被单核巨噬细胞吞噬和清除。本文采用体内给药，体外分离纯化巨噬细胞，测定巨噬细胞对中性红的吞噬能力。淋巴细胞由淋巴器官产生，是机体免疫应答功能的重要细胞成分，成熟淋巴细胞需依赖抗原刺激而分化增殖，继而发挥其免疫功能。自然杀伤细胞是机体重要的免疫细胞之一，不仅与抗肿瘤、抗病毒感染和免疫调节有关，活化的自然杀伤细胞可合成和分泌多种细胞因子，具有调节免疫、造血和直接杀伤靶细胞等作用。

实验证明，北沙参组可以增加小鼠胸腺、脾脏重量，增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力，提高小鼠淋巴细胞的杀瘤率和自然杀伤细胞的杀伤能力。其相关具体机制有待进一步研究。

［1］国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）［M］．北京：中国医药科技出版社，2010．92．

［2］成文娜，郭承军，石俊英．北沙参近十年的研究进展［J］．齐鲁药事，2008（27）：734．

［3］时新刚，李淑娥，孙庆雷，等．北沙参的1HNMR指纹图谱研究［J］．山东科学，2009（22）：24．

［4］舒春清，郭 杰，石玉文，等．北沙参栽培技术与繁种方法［J］．实用技术，2005（12）：36．

［5］薛庆善．体外培养的原理和技术［M］．北京：科学出版社，2001．30－38．

［6］鄂 征．组织培养技术［M］．北京：人民卫生出版社，1982．245－289．

［7］陈 奇．中药药理研究方法学［M］．北京：人民卫生出版社，2006．748－752．

［8］陈 奇．中药药理研究方法学［M］．北京：人民卫生出版社，2006．755－760．

［9］陈 奇．中药药理研究方法学［M］．北京：人民卫生出版社，2006．749－754．

［10］辛 华，雨 龙．北沙参的生物学与化学成分的研究进展［J］．中草药，2008，（8）：1275．