不同剂量X线辐射对骨肉瘤HOS细胞中端粒酶的影响

张海玉，单玉兴，高 辉，丁福鹏，王 井＊

（1．吉林大学白求恩医学部第一医院 小儿外科，吉林 长春130021；2．吉林大学白求恩医学部第一医院二部 骨科，吉林 长春130021）

骨肉瘤（成骨肉瘤）是最常见的恶性骨肿瘤。据WHO统计，发病率很高，占原发恶性骨肿瘤的22．36%。典型骨肉瘤一般见于10－20岁年龄段，但在任何年龄段都可发生，包括婴幼儿，儿童以及老年人。男性发病率较高，男女之比约2∶1。具有很强的局部浸润能力和肺转移能力。虽然手术和化疗的应用使骨肉瘤的预后有很大的提高，但是很多患者因耐药而预后不好。端粒酶在肿瘤细胞的发生，发展中所起的作用已被人们广泛的认可。大量的研究表明，90%以上的肿瘤细胞都具有较高的端粒酶活性，而多数的体细胞则缺少端粒酶活性。这便给了人们攻克肿瘤的希望，放射生物学研究表明，电离辐射作用后可改变细胞周期的进程［1，2］，但是射线照射后骨肉瘤细胞中的端粒酶活性报道甚少。本实验通过研究不同剂量的X射线辐射对骨肉瘤细胞中端粒酶活性的影响，为放射治疗骨肉瘤的临床应用提供理论依据。

1 材料和方法

1．1 细胞培养

人骨肉瘤HOS细胞系，购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司。培养基为含10%灭活小牛血清的高糖含酚红DMEM（GIBCO公司），内含100U／ml青霉素和100U／ml链霉素。将每孔以1×104个细胞接种于96孔培养板中，在37℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱中培养3d，以备照射。

1．2 X射线

X射线能量为6MeV／u，靶皮距100cm，剂量率2Gy／min，设定细胞吸收剂量为0Gy（对照细胞）、1、2、4和8Gy。每个剂量点设3个平行样，全部过程在室温下进行。细胞照射后，立即更换培养液，继续培养72h。

1．3 辐射敏感性测定

采用MTT法检测细胞存活。继续培养72h后每孔加入 MTT溶液（5mg／ml）20μl，培养箱内继续培养4h，终止培养，弃去孔内培养液。每孔加入150μl DMSO，振荡10min。选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记录结果。以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生长曲线。细胞存活分数（survival fraction，SF）计算公式为：sF（%）＝（实验组OD值／对照组OD值）×100%。最后以3个平行样品的sF均值±标准差（¯x±s）绘制剂量－存活曲线。

1．4 指标检测

1．4．1 端粒酶活性测定 用酶联免疫法检测端粒酶活性。Elisa试剂盒来源于北京鼎国昌盛生物技术有限公司。将被检样品以1∶50，1∶100，1∶200，1∶400建立浓度梯度，将稀释好的样品加入酶标反应孔中，每样品加3孔，每孔100μl，依据Elisa试剂盒使用说明进行操作，检测端粒酶活性。

1．4．2 端粒酶逆转率酶（hTERT）测定 应用免疫组化法检测hTERT的表达情况。SP试剂盒来源于北京鼎国昌盛生物技术有限公司。用4%的多聚甲醛磷酸缓冲液固定细胞爬片10－20min，干燥后PBS冲洗3次。然后具体操作依照试剂盒说明。应用image pro plus软件对免疫组化图像进行半定量分析。

1．4．3 端粒酶RNA测定 RT－PCR检测端粒酶基因的表达：按Trizol Reagent RNA提取试剂提取总RNA。测定端粒酶RNA的两条引物序列分别为：5′－ACCACCAGCGTGTCTGGAGCAAGCCCA AC－3′和 5′－GGGCAACGAAGCGGAGTCGCTGGCACTG－3′，RT－PCR的 产 物用1．5%的琼脂糖凝胶电泳。葡萄糖－3－磷酸脱氢酶作为内对照。

2 统计学分析

统计学处理：采用SPSS进行统计学处理。数据以¯x±s表示，组间比较采用t检验。

3 结果

3．1 X线照射后细胞存活

细胞存活曲线描述了辐射吸收剂量与细胞存活分数之间的关系。用MTT法测定，设3个平行样，细胞存活曲线按对数标度绘制。（见图1）。骨肉瘤HOS细胞的存活明显降低，而且未见明显的后期细胞增殖。相关性分析结果显示，细胞的存活率与辐照剂量呈负相关（P＜0．01）。

图1 不同剂量X线照射后72h细胞存活曲线

3．2 X线照射后端粒酶活性

细胞受照后72h进行端粒酶提取和 酶联免疫法端粒酶活性检测（见图2）。由图可知其端粒酶活性随辐照剂量增加而增高。其中，辐射剂量在1 Gy、2Gy处，其端粒酶活性较对照组升高相对较小；辐射剂量在4Gy处，端粒酶活性最强，实验组明显高于对照组，且增长势头强劲；而辐射剂量在8Gy处，端粒酶活性仍高于对照组，但是增长势头明显回落，可能与细胞存活率明显下降有关，可能与细胞增殖受到明显抑制有关。

图2 不同剂量X线照射后72h细胞内端粒酶活性比较

3．3 X线照射后hTERT检测

应用Image P ro Plus 5．0软件对免疫组化图像分析表明各图像灰度值逐渐降低，亦说明各图像蛋白含量逐渐增高。表格数据显示实验组的hTERT表达明显强于对照组，且表达强度明显与剂量呈正相关（见表1）。

表1 免疫组化图像灰度值分析

3．4 X线照射后端粒酶RNA的表达

抽取对照组和实验组的端粒酶RNA，应用RTPCR技术。（见图3）照射后，骨肉瘤HOS细胞内端粒酶RNA高表达，在4Gy时，电泳条带亮度最高，说明样品含量最大。总体来看，很明显样品含量与剂量呈正相关。

图3 不同剂量X线照射后72h端粒酶RNA水平

4 讨论

放射治疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，尤以X线最为普遍应用。经放射治疗后，正常细胞和恶性肿瘤细胞获得同样的杀伤效果，但是由于恶性肿瘤细胞的营养供应不足和增殖机制不完善，与正常组织相比，它的组织修复能力相对较差。这是放射治疗的基本原理。

端粒酶是肿瘤细胞无限增殖的基础，除了少数的造血干细胞，生殖细胞，T细胞，B细胞及皮肤基底层细胞等增殖细胞外，正常细胞内无端粒酶。hTERT是端粒酶的蛋白质亚单位，与端粒酶的活性高低密切相关，是端粒酶延长端粒的关键酶。人类的端粒酶有3个亚基，包括人端粒酶RNA、端粒酶相关蛋白和端粒酶逆转录酶（hTERT），前两种成分在端粒酶阴性的正常组织中广泛表达，而hTERT仅在端粒酶阳性的肿瘤细胞中表达。肿瘤细胞内没有hTERT，端粒酶无法维持端粒的长度。众多研究表明，端粒酶活性降低的关键是hTERT活性的下调；端粒酶激活的主要途径也是hTERT的表达的增强。

细胞内的DNA是放射线的靶点。X线进入人体后，产生的次级电子可直接击中细胞内的DNA双链，使其产生单链或双链断裂。水分子受到射线作用后发生电离而产生自由基，自由基和有毒成分对DNA分子产生破坏作用，达到杀死细胞的作用。

本实验表明，随着X线剂量的增加，端粒酶活性，hTERT及端粒酶RNA的表达均增高且大致同步。其中，在1Gy、2Gy处，端粒酶活性，hTERT和端粒酶RNA表达较对照组升高相对较小，但细胞存活率较高，这可能是射线量低，没能达到致死肿瘤细胞的程度；当辐射剂量达4Gy、8Gy时，端粒酶活性，hTERT和端粒酶RNA表达较对照组升高非常明显，细胞存活率急剧下降，可能是射线量达到了致死肿瘤细胞的程度，肿瘤细胞需要调动所有机制阻止细胞进入凋亡程序，hTERT和端粒酶RNA表达增强，端粒酶异常活跃。也可能是射线损伤了端粒，使端粒酶活性增强，但端粒酶活性的增强最终也没能够阻止骨肉瘤细胞进入凋亡程序。虽然在8Gy时，端粒酶活性，hTERT及端粒酶RNA含量比4Gy时的增长势头有所降低，但仍强于对照组。说明在8Gy是，单个细胞内的端粒酶，hTERT和端粒酶RNA含量的比例较其他样品均高。这些数据表明，在x射线的干扰下：X射线剂量与骨肉瘤细胞存活率呈负相关；X射线剂量与端粒酶活性呈正相关；骨肉瘤细胞存活率与端粒酶活性呈负相关；hTERT，端粒酶RNA和端粒酶活性三者属同步关系。

5 结论

也有实验表明端粒酶活性水平并不与照射后细胞的存活水平平行，但是端粒酶活性变化与辐照所用的射线及辐照剂量有关已成共识。中小剂量照射后细胞死亡数随着照射剂量的增加而增加，而修复反应明显，常表现出酶活性的增高。以上实验数据能否真实地反映放疗对骨肉瘤细胞的杀伤性，是否能够确定放疗对骨肉瘤细胞的疗效，还不能确定；端粒酶是否参与放射诱发的损伤修复及端粒酶活性检测，能否用于放疗效果评估有待深入研究；端粒酶与放射治疗的关系还有待进一步探讨。

［1］Teyssier F，Bay JO，Dionet C，et al．Cell cycle regulation after exposure to Ionizing radiation［J］．J Bull Cancer，1999，86：345．

［2］Hwang A，Muschel RJ．Radiation and the phase of the cell cycle［J］．J Radiat Res，1998，150：52．