RNAi－chk1在抑制小鼠Lewis肺癌细胞生长作用的实验研究

侯吉光，张 奇，王红勇，贾晓晶，贾 杰

（1．吉林大学第二医院 放疗科，吉林 长春130041；2．吉林大学第二医院肿瘤 生物治疗科，吉林 长春130041；3．吉林大学中日联谊医院 电诊科）

细胞周期检测点激酶1（Chk1）是细胞周期检测点（G1／S、S和G2／M）中非常重要的蛋白激酶，它们通过信号传导和放大，调节下游靶蛋白表达，使细胞周期出现阻滞。抑制Chk1蛋白表达，可有效地消除肿瘤细胞在放射线或化疗药物作用后的细胞周期阻滞，抑制肿瘤放疗、化疗所导致的DNA损伤进行修复，从而增加放化疗的敏感性［1，2］。由于阻断剂技术本身存在诸多缺陷，这极大地限制其应用于临床肿瘤治疗［3，4］。而小片段干扰核糖核酸（small interferenceRNA，siRNA）技术能较好地解决应用阻断剂所带来的问题，从而可为肿瘤放射基因治疗研究提供新途径。本文在前期实验基础上应用chk1－536的RNAi载体转染Lewis肺癌细胞株，观察chk1－RNAi联合放疗对Lewis肺癌细胞株凋亡的影响。

1 材料与方法

1．1 材料 TR Izol Raegent、脂质体 LipofectimineTM2000、DMEM 培养基、胎牛血清，Invitrogen公司；MTT，Sigma公司。Lewis肺癌细胞株，本室保存。pGPU6／GFP／Neo－chk1－536，本室在前期工作中已经成功构建、鉴定、筛选［5］。

1．2 方法

1．2．1 转染Lewis肺癌细胞株 转染前：2－3×106个细胞接种于6孔培养板中，37℃，5%CO2孵箱中培养过夜，使细胞达80%融合，此细胞密度为细胞转染所必需。转染前用不含抗生素的无血清培养基洗两次，加0．8ml无血清且不含抗生素的培养基。转染：取1μg质粒DNA，加无血清且不含抗生素的培养基至100μl，同时用无血清且不含抗生素的培养基将10μl LipofectamineTM2000稀释至100μl，室温孵育5min。将这两种溶液缓慢混和，室温孵育10－15min，将此混和物加到细胞上，缓慢混和。37℃，5%CO2孵箱中培养，转染24、48、72h后分别收集Lewis肺癌细胞，待下一步检测。

1．2．2 RT－PCR检测chk1基因 TR Izol提取各组细胞总RNA，取1μg总RNA进行RT－PCR扩增。以 Parp1 的 引 物 Parp1p1：5＇－TCCCAAGGACTCCCTCCGCATGG－3＇、Parp1p2：5＇－CTTTGCCTGCCACGCCTCCAGCC－3＇进行 RT－PCR，扩增片段为210bp，检测Parp1mRNA的表达情况。

以β－actin P1：5＇CGTTGCGTTGCTATCCAGGCTGTGCTA 3＇，β－actinP2：5＇CCAGGTCCAGACGCAGGATGGC 3＇为内参照，扩增片段为143bp。将PCR扩增产物在1．5%的琼脂糖凝胶上电泳。收集chk1mRNA，进行RT－PCR检测。

1．2．3 照射条件 采用Philips深部X射线治疗机，电压200kV，电流10mA，滤板0．5mm Cu和1．0mm Al。球靶距50cm，剂量率0．287Gy／min，总剂量为2Gy。将Lewis肺癌细胞含5×106个细胞／ml接种于25cm2底面积的培养瓶中。照射前一天更换新鲜培养基。照射后24h检测chk1蛋白表达的变化。

1．2．4 实验分组 空白对照组、错义序列组、siRNA组，2Gy照射组、2Gy照射＋错义序列组、2Gy照射＋siRNA组

1．2．5 MTT法检测细胞抑制率 上述转染细胞48h时，进行2Gy照射，24h后分别加入 MTT 10 μl，振荡15min，酶标仪检测吸光度（A）值。计算细胞抑制率，肿瘤细胞生长抑制率＝（1－A／B）×100%。

1．2．6 流式细胞术检测转染siRNA后细胞的凋亡各组细胞以1．5×105／L密度接种于25cm2培养瓶，以方法1转染后继续培养48h，进行2Gy照射，24 h后胰酶消化、离心收集并悬于PBS中，4℃、70%乙醇固定30min，用含RNase及碘化丙锭（PI）的染色液染色30min。应用流式细胞仪进行细胞凋亡分析。

1．2．7 统计学方法 数据以均数±标准差（x—±s）表示，以SPSS 13．0统计软件处理，采用方差分析作差异的显著性分析，P＜0．05为差异具有显著性意义。

2 结果

2．1 转染细胞chk 1mRNA表达水平 各组210 bp处均可见清晰条带，siRNA和2Gy照射组＋siRNA组条带明显减弱，各组内参照β－actin条带一致，见图2．1。

图2．1 RT－PCR检测转染细胞的chk1的表达

2．2 siRNA对小鼠Lewis肺癌细胞生长的抑制pGPU6／GFP／Neo－Chk1－536转染组及2Gy照射组的吸光度值与空白对照组比，差异显著（t＝4．262－7．183，P＜0．05）；2Gy照射组＋pGPU6／GFP／Neo－Chk1－536组的吸光度值与2Gy照射组、pGPU6／GFP／Neo－Chk1－536组比较差异有显著意义（t＝4．149－5．957，P＜0．05）。2Gy照射组＋pGPU6／GFP／Neo－Chk1－536组对Lewis肺癌细胞的抑制率最高，为63．3%。

2．3 siRNA对Lewis肺癌细胞凋亡的影响 pGPU6／GFP／Neo－Chk1－536转 染、2Gy 照 射 可 诱 导Lewis肺癌细胞凋亡，与正常对照组比，差异显著（t＝3．586－3．75，P＜0．05），并且 pGPU6／GFP／Neo－Chk1－536转染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌细胞凋亡（t＝2．674－2．838，P＜0．05）。

3 讨论

当细胞受到放、化疗损伤后，细胞可通过细胞周期检测点信号传导通路激活细胞的G0、S、G2／M各期的细胞周期检测点，使受损的细胞停滞于各个细胞周期，并对受损的DNA进行修复，从而避免过多的细胞产生凋亡［6，7］。在细胞周期检测点信号传导通路中，细胞周期检测点激酶（Chk1）起着重要作用。Chk1主要通过以下机制保护细胞的基因组免受外界因素的损伤：受损的DNA活化chk1，致使细胞阻滞在S期、G2／M期检测点，受损的DNA得以修复，从而维持基因组的完整性；反之，若损伤广泛无法修复时则会诱导凋亡［8］。近年来研究表明，通过特异性基因阻断剂抑制肿瘤细胞DNA损伤修复过程中关键调控基因功能，可以抑制DNA修复，增强其放疗效果。电离辐射诱导DNA损伤信号传导途径使检查点G1／S和G2／M激活，延迟细胞周期进程，为DNA损伤修复争取时间。

RNA干扰是一项强大的阻断真核细胞中特异表达蛋白的技术，是利用21－23bp小干扰RNA片段诱导序列互补mRNA降解，导致目的基因转录后活性下调，从而调控生物体内功能基因表达［9］。siRNA也可通过抑制DNA损伤修复酶（如DNA－PKcs、ATM、ATR等）而增强肿瘤细胞对化疗、放疗的敏感性，增强杀瘤活性［10］。目前该技术已广泛应用于基因治疗研究，且开始进入肿瘤治疗领域，利用siRNA技术封闭癌基因成为高特异性治疗肿瘤的新希望［11，12］。

本实验中，我们为了进一步研究chk－1功能，在前期实验中利用RNAi技术，针对小鼠chk－1基因序列已经成功设计并构建了4个RNAi质粒，酶切及测序鉴定正确后，分别转染Lewis肺癌细胞，筛选出转染效果最好的重组质粒；在后期实验中，我们设计了6个实验组，即空白对照组、错义序列组、siRNA组、2Gy照射组＋错义序列组、2Gy照射组、2Gy照射组＋siRNA组来研究PARP－1放疗抑瘤作用。siRNA是在mRNA水平抑制基因表达，mRNA表达减少，并不一定就意味蛋白质表达降低，各种分子的生物功能的执行者是蛋白质，只有蛋白质的表达受到抑制，才能影响该基因的生物功能。因此，实验中必须确定chk－1mRNA表达是否受到抑制。检测蛋白表达最常用的经荧光观察及抗性筛选后决定转染成功后，进行了蛋白质免疫印迹半定量检测，通过流式细胞仪检测细胞细胞凋亡，MTT检测细胞数，并计算抑制率。免疫组化、Western Blot及RT－PCR检测chk1阻断前后表达量变化，结果显示2Gy照射组＋ pGPU6／GFP／Neo－chk1－536组对Lewis肺癌细胞的抑制率是63．3%，是各组中最高的，差异有显著性（P＜0．05）。chk阻断后在细胞中表达量明显降低。pGPU6／GFP／Neochk－536转染、2Gy照射可诱导Lewis肺癌细胞凋亡，与正常对照组比，差异显著（P＜0．05），并且pGPU6／GFP／Neo－chk1－536转染可增加2Gy照射引起的Lewis肺癌细胞凋亡（P＜0．05）。表明RNAi沉默chk1基因的表达，针对chk1的RNAi可以提高Lewis肺癌细胞的抑制率和凋亡。

总之，对chk－1的研究在一定程度上推动了DNA修复机制的研究，有助于我们进一步探索肿瘤的发生机制和治疗策略。将来恶性肿瘤治疗策略是对肿瘤细胞的特异性杀伤，而对正常细胞DNA影响很小的基因靶向治疗。随着RNA干扰技术的进一步完善，针对chk－1的靶向辐射增敏将会在肿瘤治疗中发挥重要作用。

［1］Bartek J，Lukas J．Chk1and Chk2kinases in checkpoint control and cancer［J］．Cancer Cell，2003，3 （5）：421．

［2］Zhou BB，Sausville EA．Drug discovery targeting Chk1and Chk2 kinases［J］．Prog Cell Cycle Res，2003，5：413．

［3］Ponder BA．Cancer genetics［J］．Nature，2001，411（6835）：336．

［4］Khanna KK，Jacson SP．DNA double stand breaks：signaling，repair and the cancer connection［J］．Natuere Genetic，2001，27：247．

［5］王铁君，郭喜平，董丽华等．小鼠Chk1基因RNAi表达质粒的构建与筛选［J］．中国生物制品学杂志，2009，22（4）：359．

［6］Robinson HM，Black EJ，Brown R，et al．DNA mismatch repair and Chk1－dependent centrosome amplification in response to DNA alkylation damage［J］．Cell Cycle，2007，6（8）：982．

［7］Tao ZF，Lin NH．Chk1inhibitors for novel cancer treatment［J］．Anticancer Agents Med Chem，2006，6（4）：377．

［8］Petridou E，Belechri M，Dessypris N，et al．Leptin and body mass index in relation to endomet rial cancer risk［J］．Ann Nutr Metab，2002，46（3／4）：147．

［9］Gitlin L，Karelsky S，Andino R．Short interfering RNA confers intracellular antiviral immunity in human cells［J］．Nature，2002，418（6896）：430．

［10］Carthew RW．RNA interference：the fragile X－syndrome connection［J］．Curr Biol，2002，12（24）：852．

［11］刘丽萍．治疗性siRNA 的研究进展［J］．国外医学药学分册，2004，31（5）：269．

［12］Dorsett Y，Tuschl T．siRNAs：App lications in functional genomics and potential as therapeutics［J］．Nat Rev D rug D iscov，2004，3（4）：318．