耐亚安培南的铜绿假单胞菌OprD2的缺失与金属β－内酰胺酶编码基因的研究

郝维敏

（宿州市立医院 检验科，安徽 宿州234000）

铜绿假单胞菌是医院感染的常见致病菌，免疫力低下的患者可引起严重的呼吸机相关性肺炎、败血症、烧伤创面和泌尿系统感染等，在临床抗感染治疗中，容易对临床常用的抗生素产生耐药，且耐药机制复杂。亚胺培南曾经是铜绿假单胞菌治疗的有效药物［1］，但随着亚胺培南的广泛应用，其敏感性逐年下降。研究表明，亚胺培南进入细菌的通道蛋白OprD2的缺失，染色体介导的头孢菌素酶的产生，非特异性药物的主动外排系统和产金属β－内酰胺酶都可以导致铜绿假单胞菌对亚胺培南的耐药［2，3］。为了解本院耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中外膜蛋白OprD2的缺失及产金属β－内酰胺酶（MBLs）菌株编码基因的携带情况，我们收集了本院2009年1月—2010年1月所有耐亚胺培南的铜绿假单胞菌的临床分离株，并对这些菌株的OprD2的缺失及产金属β－内酰胺酶菌株的编码基因进行了研究。

1 材料与方法

1．1 材料

1．1．1 菌株来源 收集本院2009年1月—2010年4月临床分离的耐亚胺培南的铜绿假单胞菌76株，所有重复菌株均排除在外。76株不重复菌株分别分离自痰标本（58株），伤口分泌物（18株），尿标本（4株），血培养（3株），其他标本（3株）。76株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌分别来自ICU38株，干部病房15株，外科病区10株，呼吸科6株，泌尿科4株，感染科3株。标准质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853购自卫生部临检中心，产IMP和VIM型金属酶的菌株由安徽医科大学第一附属医院检验科细菌室惠赠。

1．2 检测方法

1．2．1 仪器试剂 法国梅里埃公司的VITER32全自动微生物分析仪，PCR扩增仪为美国PE公司产品，电泳仪为北京六一仪器厂生产，紫外凝胶电泳成像系统由安徽医科大学第一附属医院提供。MH琼脂和亚胺培南药敏纸片购自Oxoid公司，EDTA购自Sigma公司，PCR的Master试剂购自上海生物工程公司，引物合成序列由分析由上海生物工程公司合成。

1．2．2 细菌鉴定及药敏试验 用VITER32全自动微生物分析仪配套的鉴定卡将细菌鉴到种，琼脂稀释法测定76株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌的最低抑菌浓度（MIC），按美国实验室标准化委员会（CLSI）的最新推荐标准判定结果。

1．2．3 产MBLs菌株筛选 采用亚胺培南－EDTA纸片增效法进行检测。按照标准纸片扩散法药敏试验操作规程，在M－H平板上涂抹待检菌，分别贴2张IMP药敏纸片，纸片间距为30－40mm，其中一张IMP纸片加EDTA溶液15ml，37℃孵育24小时，加EDTA纸片抑菌圈直径比不加EDTA纸片抑菌圈直径≥7mm为MBLs阳性。

1．2．4 PCR耐药基因的检测 扩增用模板制备采用煮沸法。反应总体积为50μl。检测OprD2的基因 （F 5′－GGAATAGAGTGGCTTAATTCTC，R 5′－GCCACGCGATTTGACGGAG 193bp），IMP型基因（F 5′－TTTCATAGCGACAGCACG，R 5′－TGCGTCTCCAACTTCACTG 378bp）、VIM 型（F 5′－TCCGACAGTCAGCGAAAT， R 5′－GCAGCACCAGGATAGAAGA 435bp）、金属β－内酰胺酶的引物由上海生工公司合成。

检测OprD2基因的反应条件为93℃3min预变性，93℃1min、55℃1min，72℃1min循环35次，最后，72℃5min充分延伸。检测MBLs各基因的反应条件为：先94℃4min预变性，然后94℃1min、55℃1min、72℃1．5min循环25次，最后72℃10 min充分延伸。PCR产物经0．8%琼脂糖凝胶电泳后观察结果。

1．2．5 数据分析 用 WHONET5．3软件对细菌的MIC结果进行耐药性分析。

2 结果

2．1 药敏试验结果 76株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌药敏试验结果见表1。

表1 76株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌药敏试验结果

2．2 OprD2基因的检测结果 经PCR扩增OprD2基因发现：76株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中19株（25%）表达OprD2的基因，其余57株（75%）OprD2基因缺失，见图1。

2．3 MBLs及其基因检测结果 本次实验收集的76株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌经亚胺培南—EDTA纸片增效试验检出16（21．1%）株产 MBLs，经过基因扩增试验证实，其中13株携带VIM型基因，另3株携带IMP型基因，VIM、IMP阳性扩增产物经上海生工公司测序后，证实分别为 VIM－2和IMP－1型 MBLs．（见图2、3）。16株产 MBLs的菌株都存在孔蛋白通道OprD2的缺失。

图1 OprD2膜孔蛋白基因检测结果

3 讨论

本研究选用的76株铜绿假单胞菌除对亚胺培南耐药外，对其它抗生素均有较高的耐药性，其中氨曲南耐药率达73．7%，环丙沙星达53．9%，庆大霉素达94．7%，头孢他啶达43．4%。

图2 MBLs阳性结果

目前有关耐亚胺培南的铜绿假单胞菌的耐药机制主要涉及到高产AmpC酶、金属β－内酰胺酶的水解、药物的主动排除和外膜蛋白OprD2的减少或缺失［4］。通常外膜蛋白OprD2基因缺乏是介导铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的主要机制［5］，因为亚胺培南是分子量较小的亲水性β－内酰胺类药物，可以通过细菌外膜上具有通透性功能的外膜蛋白OprC、OprD2、OprE扩散，但OprD2是亚胺培南通过的特异性通道［6］，本院76株分离的耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中，OprD2基因缺失51株，缺失率达75%，表明外膜蛋白中OprD2的表达缺乏在我院临床分离的耐亚胺培南的铜绿假单胞菌中存在，是主要的耐药机制。

金属β－内酰胺酶主要有IMP型和VIM型，近年来又发现SPM－1型和GIM－1型等类型，能灭活青霉素类，头孢菌素类和碳青霉烯类抗生素，但对氨曲南无水解活性，可被EDTA等金属螯合剂抑制，但不被β－内酰胺酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦和他唑巴坦抑制［7］，所以我院分离的耐亚胺培南的铜绿假单胞菌对氨苄西林／舒巴坦的耐药率为100%。我院分离的76株耐亚胺培南的铜绿假单胞菌产MBLs16株，其中 VIM－2型13株，IMP－1型3株，表明我院存在产VIM－2型和IMP－1型MBLs菌株的流行。VIM－2型基因主要存在染色体上［6］，仅少数存在质粒上。而IMP－1基因大多位于质粒上，但它们多数位于Ⅰ类整合子结构中，常同时携带氨基糖苷类耐药基因，所以成多重耐药，医院环境中出现的产MBLs的铜绿假单胞菌给临床治疗带来极大的困难，同时也是感染控制部门面临的一个严峻的问题。产MBLs菌株的准确检测和报导对于阻止多重耐药菌的蔓延起到非常重要的作用。本次分离的16株产MBLs的耐亚胺培南的铜绿假单胞菌，OprD2基因全部缺失，表明临床分离的耐亚胺培南的铜绿假单胞菌存在多重耐药机制。因此，我们建议所有临床分离的铜绿假单胞菌都应常规进行OprD2基因和产MBLs的检测，减少碳青霉烯类抗生素的不合理使用，从而防止医院内耐药菌的传播。

［1］王 晶，韩丽霞．耐亚胺培南铜绿假单胞菌的β－内酰胺酶类耐药基因研究［J］．大连医科大学报，2009，31（5）：583．

［2］徐元宏，沈继录，杨佰侠，等．产金属酶合并外膜蛋白缺失的铜绿假单胞菌的检测［J］．中华医院感染学杂志，2005，15（10）：1085．

［3］WangC，WangJ，MiZ．Pseudomonas aeruginosa producing VIM－2 metallo beta－lactamases and carrying two aminoglycoside－modifying enzymes in China［J］．Hosp Infect，2006，62（4）：522．

［4］Quale J，Bratu S，Gupta J，etal．Interplay of efflux system，ampC，and oprD expression in carbapenem resistance of Pseudomonas aeruginosa clinical isolates ［J］．Antimicrob Agents Chemother，2006，50（5）：1633．

［5］Diallo Mamadou Cherif，魏殿军，曹 阳，等．耐亚胺培南铜绿假单胞菌oprD2基因与金属酶的检测［J］．中华感染与化疗杂志，2008，8（5）：369．

［6］熊 薇，王洪波，徐 敏，等．铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD2缺乏和金属β－内酰胺酶与亚胺培南耐药的关系［J］．中华医院感染学杂志，2007，17（10）：1193．

［7］甘晓玲铜绿假单胞菌对碳青霉稀类抗生素的多重耐药机制［J］．重庆医学，2008，37（16）：1851．