印度尼西亚PadangCermin热泉古菌多样性分析

沈继红，宋维志，林学政，王 帅，Dewi Seswita Zilda

（1.国家海洋局 第一海洋研究所，山东 青岛 266061；2.国家海洋局 海洋生物活性物质重点实验室，山东 青岛 266061；3.印度尼西亚海洋与渔业研究局 海洋生物技术与水产品加工研究中心，雅加达 999006）

极端生境微生物资源的研究与开发已发现了丰富特殊的嗜热菌和超嗜热菌。嗜热菌／超嗜热菌不仅具有很高的最高生长温度（maximum temperature of growth，Tmax），而且具有很高的最低生长温度（minimum temperature of growth，Tmin）［1］。热泉和热液口生态系统生存着许多嗜热／超嗜热微生物，其中部分菌株可在高达110°C的条件下，以各种各样的代谢方式厌氧或好氧生长［2］。对热耐受性最强的生物是形态像细菌的单细胞生物，称为古菌（以前叫古细菌）。古菌和细菌的不同之处在于其细胞膜脂类的化学结构、细胞壁和核糖体的结构及其对抗生素的生长敏感性［1，3］。古菌域分为广古菌门（Euryarchaeota）、泉古菌门（Crenarchaeota）、初古菌门（Korarchaeota）和纳古菌门（Nanoarchaeota）。古菌研究起步较晚，由于缺乏足够的纯培养物和16SrRNA基因的序列信息，目前初古菌门和纳古菌门的分类地位还不能完全确定，研究相对普遍的是泉古菌门和广古菌门［4］。

古菌具有在各种极端生境，如极高温、高盐、极低酸性pH等条件下生存与繁殖的能力，是目前生物地球化学循环研究的热点之一［5］。实际上，最近的分子生态学研究表明，该原核域的生命是无处不在的，它不仅可以在各种极端条件下生存，在普通海洋环境中也广泛存在［6－12］。除了生活在美国黄石公园热泉和西伯利亚永久性冻土等极端生境外，古菌在每一种生境，从花园土壤到口腔，从珊瑚礁到人类肠道中几乎均可以被发现［5］。在自然界的高温环境中，热泉、sulfatara和地热土壤是最普通和易达的生境。由于其巨大的丰富性，古菌在地球的生物地球化学循环过程中发挥着重要的作用［5，13－14］。

已利用免培养的分子系统发育分析技术对不同热液生态系统的微生物多样性进行了研究［15－17］。然而，关于陆地热泉和深海热液口的微生物多样性及其在生物地球化学循环中作用的认识仍显不足。本研究拟利用基于16SrRNA基因的系统发育技术对印度尼西亚苏门答腊岛Padang Cermin热泉的古菌多样性进行研究，并与其他热泉进行比较分析，以期了解该地区热泉的古菌多样性。

1 材料与方法

1.1 样 品

热泉泥样于2009－10－20采自印度尼西亚苏门答腊岛 Padang Cermin热泉（5°37′59″N，105°04′20″E）。样品采集点的温度和pH分别为97℃和6.7。样品用无菌瓶储存，并存放于冰盒中，带回实验室后4℃贮存。

1.2 环境基因组DNA的提取

采用土壤DNA快速提取试剂盒（Spin－column，DP4001，Bioteke，北京）按照说明书对环境基因组DNA进行提取，用琼脂糖凝胶电泳检验提取环境基因组的完整性。

1.3 古菌16SrRNA基因的扩增及其文库的构建

采用通用引物（21F：5′－TTCCTTGGGATCCYGCCGGA－3′，958R：5′－YCCGGCGTTGAMTCCAATT－3′）扩增古菌16SrRNA基因，PCR条件参照文献［10］。

扩增到的16SrRNA基因经1%琼脂糖凝胶电泳分离后，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收目的片段（约950bp），纯化的PCR产物连接到T载体pMD18－T（D101，Takara，大连）并转化感受态细胞Escherichia coliDH5α。在含有Amp、ITTG和X－gal的LB平板上挑取白色菌落即为阳性克隆。

1.4 16SrRNA基因的限制性酶切分析

利用质粒pMD－18T的特异性引物RV－M （D3880，Takara）和 M13－47（D3887，Takara）从阳性克隆中PCR扩增插入的古菌16SrRNA基因。PCR产物（约1 000bp）经纯化后先用限制性内切酶AluⅠ酶切，具有相同酶切图谱的再用限制性内切酶MspⅠ 酶切。具有相同AluⅠ和MspⅠRFLP酶切图谱的克隆即被认为属于同一个操作分类单位（operational taxonomic unit，OTU）［18］。

1.5 分子鉴定与系统发育分析

每个OTU选取1个代表性克隆进行古菌16SrRNA基因的序列测定与分析，分子鉴定与系统发育分析参照文献［19］。

1.6 群落结构分析

热泉古菌群落结构分析所采用的方法与指数参照文献［18，20］。

1.7 16SrRNA基因序列注册号

本研究报道的未培养古菌16SrRNA基因的序列提交GenBank数据库，获得注册号分别为HQ317327－HQ317340。

2 结果与分析

2.1 克隆文库的RFLP分析与16SrRNA基因的序列分析

从构建的Padang Cermin热泉古菌16SrRNA基因文库中选取经PCR验证的含目标基因片段（约950 bp）的62个阳性克隆进行进一步分析（RFLP分析），得到10个具有不同AluⅠ酶切图谱的类群；含有1个以上克隆的7个类群再用限制性内切酶MspⅠ酶切，得到了11种MspⅠ酶切图谱特征。具有相同AluⅠ和MspⅠ的RFLP酶切图谱的克隆即属于同一个OTU，因此从62个阳性克隆中共得到14个OTUs（表1）。克隆数最多的OUT种类，即OTU2和OTU1，分别占总检测克隆数的27.42% 和20.96%，表明该两个类群在Padang Cermin热泉古菌群落中占优势地位。6个OTU种类，即OTU7－OTU9和OTU12－OTU14只含有1个克隆，占总OTUs的42.88%。从每个OTU中选取1个代表性克隆进行古菌16SrRNA基因插入片段的序列测定与分析。

从每个OTU中选取1个代表性克隆进行测序，获得长度约为950bp的古菌16SrRNA基因序列（表1），与Padang Cermin热泉古菌代表性克隆相似性最高的古菌16SrRNA基因序列见表1。相似性分析表明，Padang Cermin热泉古菌的16SrRNA与庞大的GenBank数据库中已有的rRNA序列的相似性均高于91%；有些OTU与其他热泉未培养的古菌16SrRNA的相似性可达97%，表明它们可能属于同一个属的不同种；其中有3个OTU（OTU9、OTU11和OTU14）具有较低的相似性（＜93%）表明它们可能属于新属甚至是新科。

表1 印尼Padang Cermin热泉古菌16SrRNA基因序列同源性比较Table 1 Homological analysis of 16SrRNA gene of archaea collected from hot spring in Padang Cermin，Indonesia

2.2 群落结构分析

理论上，克隆文库的库容表征样品中微生物种类的覆盖程度［18］。Padang Cermin热泉古菌群落结构分析如表2所示。可以看出，本研究所构建的热泉古菌16SrRNA克隆文库的库容Coverage（C）值为90.32%，表明该文库的覆盖程度较高，能比较真实地代表该热泉的微生物的多样性［6，18］。较低的Shannon－Wiener指数（3.11）和丰富度指数（2.18）表明，该热泉的古菌多样性较低，而较高的Simpson指数则表明，该热泉具有较强的优势菌群，这与该热泉古菌16SrRNA基因文库的PCR－RFLP分析结果相一致。

表2 古菌16SrRNA基因克隆文库酶切类型的多样性Table 2 Diversity of restriction endonuclease types in the archaeal 16SrRNA gene clone library

2.3 系统发育分析

图1 Padang Cermin热泉古菌的系统发育分析Fig.1 Phylogenetic analysis of the archaea collected from the hot spring in Padang Cermin

14个OUT种类的古菌16SrRNA基因及与其相似性最高的已发表的古菌16SrRNA基因序列用Bioedit软件进行序列比对后，采用软件Mega4.1的邻接法（neighbor－joining method）进行了系统发育分析，并构建系统发育树（图1），由图1可以看出，所检测到的Padang Cermin热泉古菌群落均属于泉古菌门，分别属于热变形菌目（Thermoproteales）、硫还原球菌目（Desulfurococcales）、杂色泉古菌（miscellaneous crenarchaeotic group，MCG）和未培养泉古菌（uncultured Crenarchaeota，UC），其中属于UC的OUT种类数量最多（50%），其次是属于硫还原球菌目的OUT种类数量较多（28.57%）。

3 讨 论

热泉含有种类繁多的嗜热微生物，包括化能无机自养菌、光能无机自养菌和化能异养菌等。传统的依赖于培养的技术仅能发现自然界中0.1%～10%的微生物［21］。免培养技术（uncultured－independent techniques），即分子生物学技术，包含了从环境基因组DNA的提取、16SrRNA基因的扩增等突破了以往依赖于培养的技术的不足，越来越多地应用于生态学研究［14］。

对构建的印度尼西亚苏门答腊Padang Cermin热泉古菌16SrRNA基因文库的分析表明，该文库克隆均为未培养的泉古菌，与其他热泉的古菌群落的相似性较低。这表明，由于其生境的独特性，Padang Cermin热泉可能具有特殊的古菌群落；此外，目前对热泉中泉古菌的多样性及其在生物地球化学中作用的认识还很匮乏。

泉古菌门作为古菌的一大分支，包含很多超嗜热生物，但在某些海洋里的超微浮游生物中也占有相当比例（尚未成功培养），也有从肠道中分离出的种类（餐古菌目），与其它古菌的主要区别在于16SrRNA的序列。从系统发育树上看，泉古菌的分支相对较短，且非常接近古菌的基部。按照伯杰氏手册，泉古菌门只分1个纲和4个目：热变形菌纲（Thermoprotei）、暖球形菌目（Caldisphaerales）、硫还原球菌目（Desulfurococcales）、硫化叶菌目（Sulfolobales）和热变形菌目（Thermoproteales）。

在本研究构建的Padang Cermin热泉古菌16SrRNA基因文库中，发现了硫还原球菌目和热变形菌目。Kormas等［22］的研究表明热变形菌目可能在热液生境中发挥重要作用。迄今为止，热变形菌目的纯培养物仅仅从高温陆地或淡水环境中分离到［15］。而对硫还原球菌目来说，尽管决定其发生的环境因子还不清楚，但好像相对较高的温度（＞85℃）比较适应其生长［15］。

本研究表明，Padang Cermin热泉古菌群落与已报道的其他热泉古菌群落的相似性较低。宋兆齐等［4］的研究也表明，中国腾冲热泉与世界其它同类热泉之间的泉古菌类群存在着一定的差异，如两温泉的克隆序列与已知GenBank上关系最近序列的平均相似性较低，无名泉为92.56%，热爆区为93%。而孙盼等［23］通过构建16SrRNA基因文库，对富含高分子有机物的云南洱源牛街热泉原核微生物多样性的分析表明，该热泉包含广古菌和泉古菌两个类群，其中以广古菌为优势类群。

生境条件决定着古菌群落的多样性及其生理与新陈代谢特征［11］。Costa等［24］报道美国大盆地热泉GBS和G04b中氨氧化菌为优势菌群，这与该热泉中高浓度的NO3－和NO2－相一致，表明硝化作用可能为厌氧菌提供了重要的电子受体。热泉古菌的多样性也与其形成时间有关，比如，在形成时间较久的热泉GBS和G04b中，其古菌群落比较类似，均都由泉古菌组成；而在形成时间较短的热泉SSW和SSE中，尽管古菌群落多样性较强，但也是以泉古菌为主［24］。对新西兰Waiotapu热泉Champagne Pool的古菌系统发育多样性分析表明，通过培养和非培养技术检测到了硫氧化菌（Sulfolobus）、硫还原菌（Thermoanaerobacter和Thermofilum）和依赖于硫的热球菌（Thermococcus），这与该热泉的理化特征相符合。作者认为，Champagne Pool热泉中丰富的硫化物为硫氧化菌、硫还原菌和热球菌的生长提供了条件［25］。

研究表明，所有与Padang Cermin热泉古菌的14个OTUs亲缘关系最近的均是未培养的古菌克隆，这和冰岛地下热泉微生物的系统发育分析结果相一致。该研究基于16SrRNA基因的分析表明，所有序列均与嗜热微生物相关，几乎所有OTUs都是新的、未得到纯培养［12］。这些研究结果均表明，该热泉具有独特的微生物生物圈，其中遍布着嗜热微生物。

有观点认为泉古菌门的所有独立种群均是极端嗜热的，而非嗜热泉古菌到目前为止仍未分离出来。嗜热泉古菌主要是在深海热烟囱和陆地热泉中发现的，特征是高温（＞80℃）和低pH值（＜6），可以化能自养方式利用还原性无机化合物，如H2和还原性硫等。泉古菌的该特性连同生命树群的深入分支说明生命最后共同的祖先可能是在热液体系中的嗜热自养生物。非嗜热泉古菌和嗜热泉古菌有很近似的系统关系，尽管非嗜热泉古菌在一般情况下是不可以培养的，但是其对敞开体系海相、陆相土壤、湖泊和地下的中低温环境的适应性日益增强［26］。

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