一株脂肽产生菌发酵参数的响应曲面法优化

单大鹏，李 旭，产竹华，刘 洋，邵宗泽

（1.国家海洋局 第三海洋研究所，福建 厦门，361005；2.国家海洋局海洋生物遗传资源重点实验室，福建 厦门，361005；3.福建省海洋生物技术重点实验室，福建 厦门，361005）

石油是土壤及海洋中的重要污染物之一，海洋溢油将经历溶解、挥发、光化学氧化分解、吸附、沉降、以及生物降解等一系列过程，其中生物降解是彻底消除油污的最重要途径，利用微生物降解作用来主动清除溢油的生物修复技术是当今非常重要的环境生物技术［1］。生物表面活性剂具有渗透、润湿、脱附、乳化、增溶、稳泡和消泡等作用［2］，有助于溶解难溶的石油烃化合物，提高石油烃污染物的降解率，因而在石油污染的治理中具有很好的应用前景［3］。在复杂环境条件（高盐、酸碱、高温等）下，仍能保持乳化作用的生物表面活性剂将具有更广泛的适用性。

生物表面活性剂的分子结构包括非极性的疏水部分和极性的亲水部分，具有两亲性质［4－5］，其疏水部分为饱和、不饱和或羟化的烃链；其亲水部分有多种形式，如糖类、氨基酸类、环状肽类、磷酸盐、醇等，它们一般都具有良好的降低表面张力和界面张力的性能［6］。生物表面活性剂最主要的是脂肽、糖脂、磷脂等，其中脂肽一般为胞外产物，离去菌体后存在于上清或者疏水层中［7－8］。现在发现的脂肽主要来自Bacillus属，如B.subitilis，B.circulans，B.cereus，B.polymyxa，B.mesentericus等。除了Bacillus产生脂肽外，其他一些种类的微生物也产脂肽。例如Mycobacteriumfortuirum，Streptomycescanus，Pseudomonasfluorescens，Serratiamarcescens等［9］。

生物表面活性剂一般产量很低，纯化成本高，因而限制了实际应用［10］。优化发酵工艺是提高生物表面活性剂产量的主要途径之一。Plackett－Burman法可以从多个因素中快速确定其中最为关键的发酵参数，Willians曾将该方法与随机平衡实验、部分因子实验相比较，认为Plackett－Burman法在筛选试验重要因子方面最为有效和准确［11］。响应面分析法中的Box－Behnken中心组合设计是一种三水平的实验设计法，适用于2～5个因素的优化实验［12］。由于该方法的试验次数均在因素数的4倍以上，一般都能获得良好的拟合结果［13］。

渤海岸边污染土壤中筛选获得表面活性剂产生菌BO2，对其进行了菌株的鉴定及生理生化分析，并利用Plackett－Burman和Box－Behnken试验，确定产生表面活性剂的最佳培养条件和培养基组成，为工业化生产的工艺优化提供参考。

1 材料与方法

1.1 菌 株

菌株BO2，于2010－07分离自渤海东营港5号码头油污染土壤，并以玻璃管形式、－80℃低温保藏于本实验室。

1.2 培养基与试剂

分离、纯化培养基采用2216E培养基：酵母粉1g·L－1，胰蛋白胨5g·L－1，磷酸铁0.01g·L－1，琼脂16g·L－1（液体培养基不加琼脂），天然海水1 000mL，pH 7.6，121℃湿热灭菌20min。

发酵培养基：酵母粉2g·L－1，胰蛋白胨10g·L－1，NH4NO31g·L－1，液体石蜡40mL·L－1，大豆油40mL·L－1，MgSO40.5g·L－1，KH2PO41g·L－1，FeSO40.28mg·L－1，SrCl20.01g·L－1，天然海水1 000mL，pH 7.6。121℃湿热灭菌20min。FeSO4·7H2O溶液经0.22μm滤膜过滤除菌后，加入到灭菌后的培养基中。

蛋白胨、酵母粉、液体石蜡、大豆油（市售）；柴油（市售零号柴油）；NaCl，KH2PO4，FeSO4·7H2O，MgSO4，NH4NO3，FePO4，SrCl2，HCl，NaOH均为分析纯。甲醇、氯仿、丙酮、二氯甲烷、乙酸、茚三酮均为分析纯。

1.3 菌株的鉴定及生理生化分析

1）革兰氏染色：菌株接种于2216E固体培养基平板上，37℃培养24h后，进行革兰氏染色并镜检［14］。

2）电镜观察：取培养24h的新鲜菌体用无菌生理盐水重悬菌体，6 000r／min离心5min弃上清，再用无菌超纯水重悬菌体，6 000r／min离心5min弃上清，将离心后的菌体用磷钨酸溶液制成悬液点在200目的铜网上，吸附3～5min后用干净的滤纸吸去多余菌液，在白炽灯下干燥1h后上透射电镜（日本电子公司JEM－1230）观察，加速电压设定为120kV并拍照。

3）生理生化鉴定：参照《常见细菌系统鉴定手册》测定菌株对糖醇利用、产酸产气、生长温度、pH范围、耐盐试验、溶菌酶抗性、V－P测定、接触酶反应、吲哚反应、明胶穿刺、淀粉水解、硝酸盐还原、厌氧生长、柠檬酸盐利用、苯丙氨酸脱氨酶活性、酪素水解和酪氨酸水解［14］。

4）16SrDNA序列测定与系统进化关系的分析：采用细菌总DNA提取试剂盒（北京赛百盛基因技术有限公司），按照说明书提取菌株BO2基因组总DNA。采用细菌16SrDNA的通用引物16Sf 5′－AGAGTTTGATCCTGGCTCAG－3′16Sr 5′－ACGGCTACCTTGTTACGACT－3′PCR 扩增16SrDNA。DNA 测序由上海美吉生物公司完成。将菌株BO2的16SrDNA序列（约1.5Kb）同GenBank数据库中选取的与其亲缘关系较近的菌株用BioEdit软件的多序列比对排列（Clustalw multiple alignment）进行序列比对，用DNA Star软件进行序列相似性比较，系统发育分析采用Mega4.0软件的邻接法（Neighbor－joining method）进行［4］。

1.4 培养方法扩大培养

从2216E固体培养基平板上挑取一环BO2菌株，接种于50mL 2216E液体培养基内，30℃，200r／min（后续试验均采用此摇床转速）活化培养2d。取0.1mL菌液再次接种到50mL 2216E液体培养基内，同条件活化培养，作为后续试验菌种。

发酵培养：以体积分数5%的接种量将活化后的菌种接种到发酵培养基中，30℃培养，进行后续试验。

1.5 表面活性剂定性分析

脂肽定性分析参考文献［15］。细菌脂肽表面活性剂多为环脂肽，经浓盐酸水解后，N－端裸露，茚三酮染色呈阳性。脂肽的薄层层析法与脂肽检测：菌株BO2于发酵培养基中，30℃培养36h后取3L发酵液，4℃、11 000r／min离心25min，取疏水层用3倍体积的正己烷除去未降解的烷烃，用氯仿∶甲醇＝1∶1等体积抽提3～4次，合并抽提液，40℃旋蒸浓缩（添加无水硫酸钠除水）至2mL。用移液器点样至已活化好的硅胶板上（德国Merck公司GF254TLC薄层层析硅胶板）。将硅胶板放入已饱和的层析缸中展开，取出硅胶板之后，待展层溶剂挥发干后于显色剂下显色［16－17］。TLC展开剂的体积比为氯仿∶甲醇∶水＝65∶15∶2，显色剂为质量浓度2g·L－1的茚三酮水溶液。

1.6 生物表面活性剂定量分析

将菌株BO2菌种接种到发酵培养基中，30℃培养。0～48h内每隔4h取样测定发酵液菌体生物量（OD600nm）以及发酵上清液的表面张力，绘制生长曲线及表面张力随时间变化的曲线［18］。分析BO2生长曲线与表面张力的变化趋势及相互关系，确定最适发酵时间。

将菌株BO2菌种接种到发酵培养基中，分别在21，24，27，30，33，36℃进行培养，定时取样测定菌体生物量（OD600nm）以及发酵上清液的表面张力，确定最适发酵温度。

表面张力的测定：采用环法JYW－200A自动界面张力仪测定表面张力［19］。

乳化性能的测定：取5mL柴油和5mL发酵上清混匀，超声处理40s，在0～24h内测量乳化层和油相高度。乳化稳定值（EI24）＝ 乳化层高度（cm）／油相高度（cm）×100%［19－20］。

1.7 表面活性剂稳定性试验

温度处理：菌株BO2于发酵培养基培养36h后取5份发酵上清液，分别20，40，60，80，100℃水浴处理1h，测定表面张力和乳化系数。酸碱处理：菌株BO2于发酵培养基培养36h后取5份发酵上清液，用6mol·L－1的HCl溶液和1mol·L－1的NaOH溶液将其pH分别调为2，4，6，8，10，静置10min，测定表面张力和乳化系数。盐度处理：菌株BO2于发酵培养基培养36h后取5份发酵上清液，分别加入NaCl，使其NaCl质量浓度为30，60，90，120，150g·L－1，静置10min，测定表面张力和乳化系数。

1.8 培养基的优化

以发酵上清液乳化系数为响应目标，采用Design Expert Version 7.0软件，进行2步法进行优化。

1）Plackett－Burman实验：Plackett－Burman实验设计目的在于确定显著因素。选取菌株BO2产表面活性剂培养基中的7个因素（胰蛋白胨、NH4NO3、液体石蜡、大豆油、FeSO4、MgSO4、KH2PO4）另加一个诱导因素（SrCl2）共8个因素作为变量，另设3个虚拟变量。每种待筛选因素设置一高一低两个水平，分别用“＋”，“－”号表示，利用Design Expert软件生成Plackett－Burman实验表格进行试验，各因素的表现水平见表1。在Plackett－Burman实验中，各变量对于乳化系数影响大小的一元拟合等式：

式中，Y是预测的响应值，β0和βi是常量系数，χi是编码的独立因素。以发酵上清液乳化系数为响应值，选取可信度大于95%的因素作为响应面设计的变量，即对表面活性剂效果促进明显的主要因素。

2）Box－Behnken响应面实验：Box－Behnken响应面实验设计用于优化培养基配方。根据Plackett－Bur－man实验的筛选结果，取可信度为95%以上的显著因素为变量；其他因素视为非显著性因素，一律取其高低值的低值。利用Design Expert Version 7.0软件生成Box－Behnken实验表格进行试验。仍以乳化系数为响应值，根据实验结果进行数学建模分析，得出能使乳化系数达到最大值的培养基配方。并根据结果进行验证实验，确认Box－Behnken分析实验的可靠性。

表1 Plackett－Burman设计中各因素变化水平Table 1 Levels of the variables of Plackett－Burman design

1.9 统计分析

所有实验数据重复测定3次，结果为平均值±标准差。实验数据用Excel 2003软件进行单因素方差分析和显著性差异分析。

2 结果与分析

图1 BO2菌株的透射电镜形态Fig.1 The transmission electron microscope photoraph of BO2

2.1 菌株形态及生理生化特性

1）形态：BO2菌株在2216E平板生长，菌落直径2～3mm，白色不透明，表面粗糙，中央隆起，外型规则，边缘平整，无晕圈。透射电镜下菌体形态为细胞呈短杆状，大小约为1.1μm×0.5 μm，无鞭毛，菌体边缘平滑（图1）。

2）生理生化鉴定：BO2菌株呈革兰氏阳性，能形成芽孢，厌氧条件不生长，甲基红试验阳性，硝酸盐还原试验阳性，葡萄糖培养产酸不产气，可液化明胶，水解淀粉，水解酪素。

3）rDNA系统发育树：16SrDNA分子鉴定结果表明菌株BO2为芽孢杆菌属（Bacillus），由系统发育树可知BO2与Bacillus methylotrophicus的亲缘关系最近（图2），同源性98.63%。

2.2 表面活性剂的薄层层析鉴定结果

利用发酵培养基，30℃培养BO2菌株36h。发酵液4℃、11 000r／min离心25min除去菌体，取疏水层提取表面活性物质。该物质经TLC展层分离，直接用茚三酮进行染色，结果呈阴性；将薄层板放入装有浓盐酸的密封瓶内原位水解后，再用茚三酮染色，显红色斑点（图3）。因此判断，BO2表面活性剂是一种环状脂肽类化合物。

图2 基于菌株BO2和相关菌株16SrDNA构建的系统发育树（邻接法）Fig.2 Phylogenetic tree constructed by the neighbor joining approach based on the 16SrDNAs of BO2and related strains

图3 菌株BO2产表面活性剂薄层色谱（TLC）Fig.3 Thin－layer chromatography of the biosurfactant produced by strain BO2

2.3 生物表面活性剂产生与菌体生长之间的关联

利用发酵培养基，30℃培养BO2菌株，结果显示在对数生长期，发酵上清液的表面张力随菌体生长而下降；20h时菌体生长进入稳定期，发酵上清液表面张力继续下降；36h时表面张力降到最低值31.0mN／m，故取36h作为最适发酵时间（图4）。

利用发酵培养基，以36h作为BO2菌株培养时间，试验结果显示30℃培养时发酵上清液表面张力值最低。故取30℃作为最适培养温度（图5）。

2.4 表面活性剂的理化稳定性

温度影响实验表明，温度升高会使BO2菌株发酵上清液表面张力小幅度上升，处理温度超过60℃后其乳化系数明显下降，最适作用温度在40℃左右（图6）。

pH影响实验结果表明，较高或较低的pH环境均会使BO2菌株发酵上清液表面张力小幅度升高，其最低点介于pH 6～8；环境pH在6以下时乳化系数急剧降低，这与脂肽的酸沉降性质相吻合，最适作用pH为8左右（图7）。

NaCl质量浓度（g·L－1）实验结果表明，BO2菌株发酵上清液表面张力随NaCl质量浓度升高有小幅度波动，其最低点ρNaCl为30g·L－1；乳化系数随NaCl质量浓度升高也有所波动，其最高点ρNaCl也为30g·L－1；整体上，菌株BO2所产脂肽类表面活性剂对不同NaCl质量浓度的适应性较好（图8）。

2.5 表面活性剂培养基的优化

1）Plackett－Burman实验：Plackett－Burman实验设计及结果见表2，D1，D2，D3为3个虚拟变量。根据表2中的实验结果，用软件进行一次回归分析，回归方程：Y（%）＝40.19＋4.01×X1＋10.31×X2＋7.46×X3＋3.62×X4－2.83×X5－5.34×X6－12.13×X7－1.79×X8。各因素的主效应分析结果见表3，X2（NH4NO3）、X3（液体石蜡）、X7（KH2PO4）可信度均大于95%，为主要影响因素。模型的显著性为96.29%（＞95%），说明模型对实验结果有很好的解释。

2）Box－Behnken优化试验

以A（液体石蜡）、B（NH4NO3）、C（KH2PO4）作为自变量，其他非主要因素维持低水平。仍以乳化系数为响应值，采用三因素三水平的Box－Behnken响应面分析法进一步对培养基进行优化，实验设计见表4，实验结果见表5。

根据表5中的实验结果，利用软件的响应面回归对其进行二次回归分析，回归方程：Y（%）＝63.80＋6.5×A－2.12×B＋1.63×C－1.75×A×B－1.75×A×C＋3.0×B×C－10.15×A2－11.40×B2－8.90×C2。

通过变异系数分析对二次方程的显著性进行分析，结果见表6。

F值为4.77（＞4）说明该模型显著，只有2.58%的机率模型不能拟合。P值为0.025 8（＜0.05）也说明模型显著，A，A2，B2，C2是显著的影响因子。模型拟合R2为0.859 8，说明该模型对实验中85.98%的情况可以解释，即模型预测与实验拟合具有较好的一致性。

各因素的响应面及等高线（图9～11）显示，预测的乳化系数最大值在曲面顶点处。通过分析预测模型得出：A，B，C的最佳值分别为0.327，－0.11，0.04，与之对应的液体石蜡体积浓度为49.80mL·L－1，NH4NO3，KH2PO4的质量浓度分别为1.39，1.54g·L－1，其他成分为酵母粉0.7g·L－1、胰蛋白胨3g·L－1、大豆油20mL·L－1、FeSO40.14mg·L－1、MgSO40.25g·L－1、SrCl20.05g·L－1、天然海水1 000 mL，对应预测的乳化系数最大值为65%。以此条件进行验证试验得到菌株BO2发酵上清液乳化系数为67.3%，在原基础上提高了14.3%，说明预测结果与实验结论一致性较高，并证明了预测模型的可靠性。

表2 Plackett－Burman设计筛选对发酵液乳化系数有显著影响的因素Table 2 Plackett－Burman design for screening of significant factors affecting EI24of the culture

表3 8个待选因素对于表面活性剂乳化系数的显著性分析Table 3 The significance analysis of 8selected factors according to biosurfactant EI24

表4 Box－Behnken实验因素与水平Table 4 Levels and factors tested in the Box－Behnken design

表5 Box－Behnken实验设计表及实验结果Table 5 Experiment design and results of the Box－Behnken design

表6 乳化系数二次响应模型的方差分析Table 6 ANOVA for response surface quadratic model for EI24

3 讨 论

系统发育分析表明，菌株BO2与Bacillusmethylotrophicus有最近的亲缘关系，目前未见报道B.methylotrophicus产生生物表面活性剂。大多生物表面活性剂由于产量较低、制备成本高导致应用受限，故直接应用发酵液为一种较可行的选择。张明露等以一株芽孢杆菌的发酵液对石油烃进行乳化实验，证明了此方法的可行性［21］。芽孢杆菌BO2菌株无需诱导就能利用简单廉价的氮磷营养和石蜡，产生环状脂肽类表面活性剂乳化石油，发酵2d后可使培养基表面张力由53.0mN·m－1降至31.0mN·m－1。研究中还发现，BO2菌株的表面活性剂适用于多种极端环境，包括高盐（ρNaCl为150g·L－1）、碱性（pH10）、较高温度（60℃），其乳化能力和降低溶液表面张力均有良好的表现，因此其适用范围广、耐受能力强，具有潜在的应用价值。

国内外一些研究应用RSM法优化产表面活性剂菌株的发酵培养基，刘佳等以菌体生长量为响应系数对一株产碱杆菌的培养基进行优化，证明石蜡、牛肉膏、K2HPO4／KH2PO4为显著因素［22］。Sivapathasekaran等以表面活性剂粗提物为响应系数，对一株环状芽孢杆菌的培养基进行优化，证明葡萄糖，尿素、SrCl2、MgSO4为显著因素［23］。Chen等以表面活性剂粗提物产量为响应系数，对一株铜绿假单胞菌的培养基进行优化，MgSO4和FeSO4为显著因素［24］。Mutalik等以表面活性剂粗提物产量为响应系数，利用RSM方法中的中心复合设计（CCRD）对一株铜绿假单胞菌的培养基进行优化，证明甘露糖醇、酵母粉、蛋白胨和十六烷为显著因素［25］。以上试验说明RSM法是一种可行的培养基优化试验方法，也说明了影响不同菌株产表面活性剂的因素差异很大。然而菌体生长量以及表面活性剂粗提物作为乳化系数在反映表面活性剂实际效价上都有所偏差，未能真正体现实际应用中表面活性剂的作用效果。本研究采用RSM法的Box－Behnken设计，以发酵液乳化系数作为响应值来优化Bacillus菌属产生物表面活性剂培养条件，可以直接准确反映发酵液（生物表面活性剂）的效价，确保了优化实验的可靠性，结果表明，所选因素KH2PO4，NH4NO3对乳化能力的影响最大，其次是液体石蜡。因此，针对目前生物表面活性剂产量低，不易分离纯化的问题，实际应用中，菌株BO2可利用简单廉价的氮磷营养和石蜡发酵，并直接采用发酵上清液作为表面活性剂乳化石油，既可简化操作，又能降低成本。

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