普伐他汀对H2O2诱导的人骨髓间充质干细胞凋亡的影响

林海泓 罗心平 施海明 龚辉

（1.复旦大学附属金山医院心内科，上海 201508；2.复旦大学附属华山医院心内科，上海 200040）

骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）移植为治疗心肌梗死提供了新思路，但是MSCs移植后的存活率低，使得归巢到损伤心肌的干细胞数量甚少，这极大地影响了MSCs移植的临床应用效果[1]。

他汀类药物除具有降脂作用外，还具有促血管生成、改善内皮功能障碍、抗氧化、抗炎等作用。近年来人们逐渐开始关注他汀类药物与干细胞的关系。文献[2－3]报告，他汀类药物可增加外周血内皮祖细胞数量，延缓其衰老，从而加快受损血管内皮的修复，这可能是他汀类药物心脏保护作用的机制之一，据此推测其对MSCs也可能有类似作用。本研究旨在探讨普伐他汀在体外对H2O2诱导的人MSCs凋亡的影响及其相关机制。

1 资料与方法

1.1 主要试剂 低糖DMEM及胎牛血清购自美国 HyClone公司，0.25%胰酶和0.02%EDTA液购自美国Sigma公司，淋巴细胞分离液购自上海华精生物高科技有限公司，普伐他汀购自中美上海施贵宝制药公司，细胞及组织总蛋白抽提试剂盒、BCA蛋白质定量试剂盒及二抗购自上海康成生物工程公司，PI3K／Akt通路特异抑制剂Ly294002、ERK1／2通路特异抑制剂U0126、一抗AKT抗体、ERK1／2抗体及p38MAPK抗体购自美国Cell Signaling公司，p38MAPK通路特异激动剂anisomycin购自美国Santa Cruz公司。

1.2 人MSCs的分离、培养及鉴定 严格无菌条件下采集志愿者骨髓液5 mL，肝素抗凝，用孔径为0.02 mm的输血器过滤3次，加等量磷酸盐缓冲液（PBS）混匀后，用1 mL针头沿管壁慢慢注入淋巴细胞分离液，2000 r／min离心20 min。轻轻吸出中间白色云雾状细胞层，加入PBS洗涤细胞，1000 r／min离心5 min，共洗3次。加入完全培养基后混匀，置于37℃5%CO2饱和湿度培养箱内培养。胰酶消化，1∶2传代。取第6代细胞用流式细胞仪进行细胞表型检测。

1.3 实验分组 将传代后第4天的第6代MSCs用含0.5%血清的培养液培养12 h后，随机分为5组。普伐他汀组换用含10μmol／L普伐他汀的完全培养基；对照组则始终用完全培养基；另3组分别用20μmol／L的Ly294002、20μmol／L的U0126以及10 mg／L的anisomycin预处理1 h后，换用含普伐他汀10μmol／L的完全培养基。1 h后所有组均用含1 mmol／L的H2O2的完全培养基培养。12 h后在显微镜下观察细胞形态。

1.4 膜联蛋白V／PI双染流式细胞术检测细胞凋亡 各组细胞经PBS洗涤后，消化并重悬为细胞悬液，收集于10 mL的离心管中，每样本细胞数为（1～5）×106／mL，离心、洗涤细胞后用100μL的标记溶液重悬细胞，室温下避光孵育10～15 min。再次离心、洗涤，加入荧光（SA-FLOUS）溶液4℃孵育20 min后，用流式细胞仪（Becton Dickinson公司）检测。

1.5 细胞蛋白提取及 Western blotting检测 按常规方法进行。

1.6 统计学处理 用Stata 7.0软件包进行统计学分析。所有数据均以均数±标准差（）表示，两组间比较用t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 人MSCs细胞鉴定 用流式细胞仪对培养第6代的人MSCs进行细胞表型分析显示，细胞CD34表达 （－），CD105（＋）、CD106（＋）。

2.2 普伐他汀对 MSCs中PI3K／Akt、ERK1／2及p38MAPK通路的影响 普伐他汀可使人MSCs的PI3K／Akt通路磷酸化水平升高，2 h后作用仍持续；也可抑制p38MAPK通路磷酸化水平，抑制作用于30 min时达高峰。但是普伐他汀对人MSCs的ERK1／2通路和总Akt、总p38MAPK水平无显著影响，见图1～3。

2.3 人MSCs经H2O2诱导凋亡后的形态检测 未经H2O2作用的MSCs贴壁生长良好，边界清楚，排列紧密，成纤维样生长，见图4。细胞经1 mmol／L H2O2作用12 h后，细胞间隙增宽，细胞体积缩小，细胞内颗粒及空泡增多，出现较多悬浮死亡细胞，有的细胞崩解为碎片，见图5。经普伐他汀预处理后再经1 mmol／L H2O2处理的细胞，形态变化显著轻于对照组，细胞形态基本保持不变，但细胞内空泡较多，见图6。普伐他汀＋Ly294002组细胞形态与对照组无显著差异，见图7。

2.4 流式细胞仪检测人MSCs经H2O2诱导后的凋亡情况 普伐他汀组和普伐他汀＋anisomycin组均能对H2O2诱导的人MSCs凋亡起到显著保护作用（P＜0.05），但普伐他汀＋Ly294002组无此保护作用，提示普伐他汀对人MSCs的凋亡保护作用可能与PI3K／Akt信号传导通路有关。见表1。

表1 药物作用后对H2O2诱导的人MSCs凋亡的影响

3 讨 论

研究[4]显示，心肌梗死后行干细胞移植不论采取何种途径，移植后的细胞仅有少量能最终到达心肌损伤部位并存活生长，而大部分移植细胞在肺、肝等器官中被发现。另有研究[5]显示，如果在急性心肌梗死后过早进行干细胞移植，大部分移植细胞可能不能在缺血后的恶劣微环境中存活。因此，当前干细胞移植面临的一个重大挑战就是如何保护移植细胞、改善细胞的存活率并促进移植细胞在受损心肌组织内分化生长，以提高细胞移植效率。

本研究对体外培养的第6代人MSCs进行细胞表型分析，发现 CD34 （-），而 CD105（＋），CD106（＋），这符合MSCs表型特征。细胞对于外界刺激的反应是通过信号之间的相互作用和交流进行的，没有任何一条通路在细胞的某种反应中独立存在，每条通路都和许多其他途径相整合，它们的相互作用、整合的强度决定了细胞的命运。

本研究发现，PI3K／Akt通路的磷酸化水平在普伐他汀刺激后15 min即可升高，至2 h时作用仍持续；p38MAPK通路磷酸化水平则在普伐他汀刺激后受到抑制，抑制作用于30 min时达高峰，随后减弱。这说明普伐他汀可激活人MSCs的PI3K／Akt通路并抑制p38MAPK通路。由于本研究结果显示普伐他汀对人MSCs的ERK1／2通路无显著影响，故其后未进行与此通路相关的凋亡实验。

移植到缺血的部位后大部分细胞可能因无法耐受缺血环境而发生凋亡，因此减少细胞凋亡可能会提高移植效率。文献[6]报告，他汀类药物具有抗细胞凋亡作用，能够保护多种细胞免受各种刺激诱导的凋亡。那么它对人MSCs的凋亡是否同样具有保护作用？本研究显示，普伐他汀可显著地减轻细胞凋亡程度。而且我们发现，激活p38MAPK途径后并不能影响药物对H2O2诱导人MSCs凋亡的拮抗效应。这一结果表明，p38MAPK途径与普伐他汀介导的抗凋亡作用无关。当用特异的PI3K／Akt通路抑制剂Ly294002阻断PI3K／AKT信号途径时，普伐他汀对人MSCs的保护作用受到抑制，提示PI3K／Akt通路的激活在普伐他汀对H2O2诱导人MSCs凋亡的抑制作用中起重要的调控作用。

本研究结果表明，普伐他汀对H2O2诱导的人MSCs凋亡有抑制作用。PI3K／Akt通路的激活参与了这种抗凋亡作用的调控。所以，普伐他汀在保护移植干细胞、改善干细胞的存活率并促进移植干细胞在受损心肌组织内生长、提高干细胞移植效率等方面具有一定价值。

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