甲状腺癌中BRAF、RET、MEN1、FOXE1等基因相关SNP位点的筛选及临床价值＊

朱晓娥，袁耿彪△，范永增，冉海涛，郑元义，王志刚

（1.重庆医科大学附属第二医院核医学科 400010；2.重庆医科大学超声影像学研究所 400010）

甲状腺癌中BRAF、RET、MEN1、FOXE1等基因相关SNP位点的筛选及临床价值＊

朱晓娥1，袁耿彪1△，范永增1，冉海涛2，郑元义2，王志刚2

（1.重庆医科大学附属第二医院核医学科 400010；2.重庆医科大学超声影像学研究所 400010）

目的分析甲状腺癌（TC）BRAF、RET、MEN1、FOXE1等14个基因的80个SNP突变位点，探讨TC的发病机制及潜在的临床诊断、治疗和预防干预价值。方法根据2011年12月前更新的纳入标准，纳入文献77篇，筛选出14个基因共80个高信息量的SNP位点。采集8例乳头状甲状腺癌（PTC）、2例滤泡状甲状腺癌（FTC）、1例未分化癌（pDTC），共11例肿瘤组织样本，分别取肿瘤组织、瘤旁组织，以及甲状腺良性肿瘤（TA）组织标本22例。采用DNA纯化试剂盒提取组织DNA，80个SNP位点采用Sequenom Mass ARRAYⓇ相对分子质量阵列技术进行序列分析，并采用SPSS17.0软件进行χ2检验分析结果。结果（1）选择14个基因的80个位点，除了BRAF的rs1733832位点在样本中未检出，其余79个位点在TC、TC癌旁组织及TA中都有表达；（2）MEN1基因的rs669976位点和FOXE1基因的rs965513位点的突变在TC和TA中的表达差异有统计学意义（P＜0.05）；（3）TP53基因的rs722494在TC及TC癌旁的表达差异有统计学意义（P＜0.05）；（4）80个SNP位点在PTC中有47.5%的位点出现融合型，2.5%的位点出现缺失；在FTC中，有7.5%的位点出现融合型，1.25%的位点出现缺失。结论TC相关14个基因对TC的发生、发展及良恶性鉴别起到重要作用，为进一步对TC复发／转移、失分化的诊断、治疗、预防干预及分子靶向抑制剂的应用提供了研究的方向和潜在的临床诊断、治疗价值。

甲状腺肿瘤；多态性，单核苷酸；基因分型

近20年来，中国的甲状腺癌（TC）发病率呈上升趋势；但近几年，随着TC规范性诊疗指南的推广与应用，降低了TC的复发／转移率和病死率，提高了患者生存率，但对于部分的复发／转移或者失分化的TC，目前仍未有特异性的诊断和治疗手段。目前，已证明有多种癌基因、抑癌基因与TC的发生、发展密切相关，在TC细胞的恶性增殖、转移、预后以及对放、化疗的拮抗起着重要作用。因此，采用快速、高效率、高通量处理TC相关基因的多个SNP位点，有助于了解不同个体基因的表型差异，不同群体对疾病的易感性，不同病理分型对药物的耐性以及患者对不同环境反应的差异［1］。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集2010年6月至2011年11月本院术后确诊为TC的患者11例，平均年龄（50.73±8.69）岁；其中乳头状甲状腺癌（PTC）8例，滤泡状甲状腺癌（FTC）2例，未分化癌（pDTC）1例，包括7组同一个患者的配对TC及癌旁组织，其中有4组PTC，1组pDTC，2组FTC；术后病理确诊甲状腺良性肿瘤（TA）患者22例，年龄23～80岁，平均（47.61±13.42）岁，包括18例滤泡性甲状腺腺瘤，2例结节性甲状腺肿，1例亚甲炎，1例甲状腺纤维腺瘤。新鲜组织样本采取离体后30min内速冻与液氮，48h后移入－80°冰箱中保存备用。

1.2 仪器与试剂 采用美国Promega公司DNA提取试剂盒，SNP分型检测的主要试剂来自美国Sequenom公司的iPLEXⓇGold Reagent Kit试剂盒，所有引物均在上海英骏生物公司合成，质谱检测及分析使用Sequenom公司Mass ARRAY Analyzer Compact系统。

1.3 方法

1.3.1 组织DNA提取 采用DNA试剂盒提取组织中的DNA，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检。质检合格的DNA将浓度调整到50ηg／μL，－20℃储存备用。

1.3.2 引物设计 采用Sequenom公司Genotyping Tools及Mass ARRAY Assay Design软件设计，待测SNP位点的PCR扩增引物及单碱基延伸引物，由上海英骏生物公司合成。

1.3.3 SNP位点筛选 根据NCBI、OMIM和KEGG网站所公布的基因和SCI收录和公开发表的文献及纳入标准，筛选出14个基因共80个高信息量的SNP位点。其中PTC:BRAF及RET 2个基因36个位点，FTC的RAS及PAX8－PPARγ2个基因7个 位点，pDTC的TP53和CTNNB1 2个基因的26个位点，及其他8个相关基因的11个位点。

1.4 统计学处理 采用SPSS17.0软件进行χ2检验分析结果，80个SNP位点采用Sequenom Mass ARRAYⓇ相对分子质量阵列技术进行序列分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 DNA样本提取结果 质检后共计11例TC及癌旁组织，其中有7组配对，4例未配对（图1）；余22例TA质检合格（图2）。

2.2 80个SNP位点在TC与TA的统计学分析 80个TC相关的SNP位点，其中除了BRAF基因的rs1733832在所有病例中均未检出外，其余79个SNP位点在TC及TA中均有突变。统计分析结果显示，多发性内分泌瘤1型（MEN1）基因的rs669976（T＞C）与甲状腺转录因子2（FOXE1）基因的rs965513（G＞A）在TC与TA间差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3 MEN1基因的rs669976位点的飞行质谱图 rs669976在纵轴质量为6215和6220的位置分别为等位位点T和C（图3、4，横坐标为强度，纵坐标为质量）；图3是TC，位点C有离子峰，位点T没有峰；图4是TA，正好相反，位点C没有峰，位点T出现峰。

图1 11例TC及癌旁组织DNA电泳

2.4 79个位点在7组TC及癌旁组织中的结果 7组TC及癌旁组织包括4组PTC，其中1组有淋巴结转移；1组pDTC，2组FTC。79个SNP位点中有4个位点在其中5组样本的癌及癌旁组织中的基因型有显著性差异（表1）。TP53基因的rs722494在3组PTC、2组FTC及1组pDTC的癌组织中表现为GC碱基融合；TP53基因的rs1794287在有淋巴结转移的PTC癌组织及FTC中表现为C碱基缺失；MEN1基因的rs607969在有淋巴结转移的PTC中表现为碱基的缺失；BRAF的rs17623382在有淋巴结转移的PTC中表现为GT碱基的融合。

图2 TA组织DNA电泳

图3 rs669976在TC中的飞行质谱

图4 rs669976在TA中的飞行质谱

表1 7组TC及癌旁组织中的4个SNP的突变情况（%）

表2 80个SNP位点在11个非配对TC样本中的分型比例（%）

续表2 80个SNP位点在11个非配对TC样本中的分型比例（%）

2.5 80个SNP位点在11个非配对TC中的基因分型情况本研究分别筛选了与TC相关的80个SNP位点，在PTC中有47.5%的位点出现杂合型，2.5%的位点出现缺失；在FTC中，有7.5%的位点出现杂合型，1.25%的位点出现缺失；在pDTC中有8.75%的位点出现杂合型，未见位点缺失。14个基因在PTC、FTC和pDTC的分型出现率，见表2。

3 讨 论

TC起病较隐匿，生物学特征多变，故鉴别诊断困难。随着分子生物学的发展和人类对TC发病机制认识的深入，基因片段诊断及治疗逐渐成为肿瘤生物学的重要组成部分［2］。

3.1 PTC 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）是生物体内重要的信号转导系统之一，MAPK的持续磷酸化或激活对细胞转化和肿瘤的发生至关重要，可导致PTC细胞表型改变［3］。BRAF是MARK信号通路的关键成分，当其发生改变时可能导致肿瘤形成［4］。RET基因属于钙黏着蛋白，编码跨膜酪氨酸激酶受体，对细胞的增殖和分化起着转换信号调节的作用。本研究中，BRAF基因的21个SNP位点不仅有单碱基型，还有杂合型，与文献报道该基因是PTC最常见的遗传突变相符，BRAF基因的rs17623382在TC与TA的基因分型中差异无统计学意义（P＞0.05），可能与TC的病理组织分型、基因检测方法、病例数以及地域、民族等因素有关。目前，未见文献报道BRAF基因分型对于PTC浸润转移的作用。本研究表明，rs17623382位点在有淋巴结转移的PTC癌旁组织中有不同的基因分型，但是否可为临床早期诊断PTC的转移提供依据，还有待进一步的研究。Cheung等［5］研究表 明，RET 基因rs1799939位点的多态性与耐药性有关，基因分型与TC形成的辐射剂量有关［6］。本研究发现，RET基因与TC的病理分型可能有关，如何将RET的基因分型与TC的形成机制及耐药性结合起来，还有待研究。

3.2 FTC 由于FTC的形态、结构与生物学行为的差异，易与甲状腺滤泡状腺瘤鉴别混淆。FTC的发病机制尚不明确，目前，文献主要报道了PPAR信号通路在FTC的形成机制中的作用，主要包括了RAS、PAX8－PPARG等基因。RAS基因是一种原癌基因，调控细胞外信号应答，细胞增殖、分化和凋亡过程。RAS基因家族中包括很多亚型，热点亚型最主要在HRAS、NRAS及KRAS，他们在FTC、PTC、间变性癌和滤泡状腺瘤中的突变率也大致相同［7］。本研究中，HRAS、NRAS、KRAS基因的位点在TC和TA中的表达差异无统计学意义（P＞0.05），可能与所选的病例太少有关；其中HRAS基因的rs12628位点的基因分型可以为TC的病理分型提供一定的临床价值，用于早期诊断和治疗。近来有研究发现，在PAX8－PPARγ阳性的FTC中，参与细胞生长、细胞代谢、血管生长、信号传导、翻译调控等相关的基因表达上调［8］。PAX8－PPARγ基因重排在FTC中的表达率较高，也见于小部分的TA，这种表达上的差异可能与多种因素有关［9］。本研究显示，rs1478、rs13073869、rs3856806及rs1801282在FTC中表现为单基因型，而在PTC中有杂合型；在TC和TA中，等位位点的出现频率差异无统计学意义（P＞0.05），可能与收集的TA大多数为滤泡性腺瘤有关，说明PAX8－PPARγ基因重排在鉴别滤泡性甲状腺肿瘤的良、恶性上，还有待进一步研究。

3.3 pDTC TP53的突变体在不同人群的癌症中都经常发生，但并没有对基因的结合位点达成共识。有报道称，p53基因突变可以加剧分化型TC向pDTC［10］。本实验中筛选的TP53基因21个SNP位点，融合突变发生率在PTC较高，在FTC较低，在pDTC中没有；而缺失在PTC和FTC概率一致；说明TP53的基因分型与TC的病理类型有一定的相关性，对于低分化腺癌形成机制的研究有帮助，故TP53抑癌基因可以作为分子诊断靶向工具。CDH1、CTNNB1基因都属于钙粘连蛋白的一种，在肿瘤细胞的侵袭和转移过程中起了一定的作用。近期文献提到了CTNNB1基因及其编码的钙粘连蛋白与TC之间有着密切的关系［11］。CDH1基因突变导致该基因功能的缺失，影响着肿瘤的生长增殖、浸润和转移［12］。实验证实CTNNB1基因的5个位点和CDH1基因的2个位点在PTC中都有碱基的杂合型，CDH1基因在FTC仅有一个出现杂合，在pDTC均为单碱基型。说明这两种钙粘连蛋白基因与pDTC的形成机制有关。

3.4 其他与TC相关的基因 FOXE1基因的rs1867277是TC形成的易感因素之一，rs965513与PTC形成的放射性环境有关。本研究中，FOXE1基因的rs965513在TC及TA的基因分型差异有统计学意义（P＜0.05）。虽然文献未报道rs1443434在TC中的作用，但本研究证实了其在PTC中出现了融合型，说明它对于TC的发生、发展起到一定作用。MEN1基因为一种新发现的抑癌基因，它的突变和缺失，导致其编码蛋白的失活。国外文献称，MEN1基因与遗传性TC的形成有一定的相关性。本研究选择MEN1基因的rs607969位点，在有淋巴结转移的一组PTC组织表现为碱基的缺失，而在癌旁组织中表现为碱基的杂合，是否可以用rs607969位点作为鉴别PTC浸润转移的手段，还有待于进一步研究。NKX2－1最初被发现也是属于甲状腺转录因子的一种，其编码的蛋白质与甲状腺球蛋白的启动有关，并调节甲状腺的生长发生和基因表达，尤其是rs944289在TC的病理分型、浸润转移及放射性环境的影响中的作用。

综上所述，与TC相关的SNP，既有与TC浸润转移相关的，也有与TC形成的放射性环境相关的，还有与TC抗肿瘤药物的耐药性相关的，采取大通量、高速、快捷的筛选TC相关SNP位点的实验技术是可行的，可以建立有效的预警系统，达到一级防预目的。

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Selection and clinical value of 80 SNP loci from BRAF，RET，MEN1，FOXE1，etc in thyroid neoplasms＊

Zhu Xiao′e1，Yuan Gengbiao1△，Fan Yongzeng1，Ran Haitao2，Zheng Yuanyi2，Wang Zhigang2（1.Department of the Nuclear Medicine，the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing400010，China；2.The Ultrasonic Imaging Institute of Chongqing Medical University，Chongqing400010，China）

ObjectiveTo analyze the 80SNP loci of 14genes about BRAF，RET，MEN1，FOXE1，ect，to study the pathogenesis and the clinical diognosis，treatment and prevention value of these genes in the TC.MethodsAccording to the criteria until December，2011，we selected 80high imformative SNPs loci of 14genes from 77PUBMEDS.We collected 11cases of TC（8cases of PTC，2cases of FTC and 1case of pDTC）and 22cases of TA.The DNA was extrated by DNA purification kit，the SNP loci sequence were analysed by Sequenom Mass ARRAY，the result were analysed with SPSS17.0.Results（1）We found the expression of 80 SNPs in the TC and TA，except rs 1733832of BRAF.（2）There were significant difference in the expression of rs669976of MEN1 and rs965513of FOXE1mutation between TC and TA（P＜0.05）.（3）The expression of rs722494from TP53detected significant difference between TC and TC paraneoplastic（P＜0.05）.（4）The incidence rate of the fusion type of 80SNPs were 47.5%，7.5%and 8.75%in PTC，FTC and pDTC；the incidence rate of the deletion type of 80SNPs were 2.5%and 1.25%in PTC and FTC.ConclusionWe study the important role of 80SNPs loci of TC in the pathogenesis，development and the identification of benign and malignant of TC.This conclusion provides future research direction and potential clinical diagnose and treatment value for TC relapse and metastasis，dedifferentiation diagnose，treatment，prevention intervention and the application of molecular targeted inhibitors.

thyroid neoplasms；polymorphism，single nucleotide；genotyping

10.3969／j.issn.1671－8348.2012.34.002

A

1671－8348（2012）34－3580－03

国家自然科学基金重点资助项目（81130025）；国家自然科学基金中加资助项目（81110219）；国家自然科学基金资助项目（30900371）。 △

，Tel:023－63693339；E－mail:yuan＿gb＠126.com。

2012－06－09

2012－08－22）