高效液相色谱法测定甲氧苄啶含量

邵耀东，胡 彬，赵小华，谢纪兰，郑贵超

（1.青岛康地恩药业股份有限公司，山东青岛266111；2.江西康地恩派尼生物药业有限公司，江西南昌330500）

甲氧苄啶（trimethoprim TMP）为广谱抗菌药物，抗菌谱与磺胺类药物类似，有抑制二氢叶酸还原酶的作用，但细菌较易产生耐药性，很少单独使用［1］。磺胺药抑制二氢叶酸合成酶，两者合用，可使细菌的叶酸代谢受到双重阻断，因而抗菌作用大幅度提高（可增效数倍至数十倍），故有磺胺增效剂之称，并可减少耐药菌株的出现，广泛应用于我国兽医临床［2－3］。有关甲氧苄啶原料含量测定方法，《中国兽药典》2005年版［4］和2010年版［5］都是非水滴定法来测定含量，非水滴定法影响因素很多，整个测定过程复杂，对环境要求较高，终点判定不准，测定结果不太理想。高效液相色谱法是目前多数药物含量测定时应用的方法，该方法专属性强、操作简便、重现性较好。为了提高甲氧苄啶含量测定的速度，简化操作过程，确保测定结果的准确性，笔者利用HPLC法进行了甲氧苄啶原料含量测定的研究，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 UV－2450型紫外分光光度仪为日本岛津公司产品；戴安170型高效液相色谱仪为美国戴安公司产品；AG285分析天平为瑞士梅特勒－托利多公司生产产品。

1.1.2 药品 甲氧苄啶标准品，中国兽医药品监察所，批号为H0160704；甲氧苄啶原料药为寿光富康制药有限公司生产，批号为201009027、201009036、201010015、201010029和201010346；甲醇，色谱纯，德国默克公司生产；其他试剂均为分析纯；水为超纯水。

1.2 方法

1.2.1 检测波长选择 精密称量甲氧苄啶标准品，加流动相：甲醇∶0.02 mol／L磷酸二氢钾溶液（30∶70）制成每1 mL中含10μg的溶液，以流动相溶液为空白对照，在200 nm～400 nm波长范围内进行紫外吸收图谱扫描，并确定检测波长。

1.2.2 色谱条件与系统适用性试验 色谱柱：Diamonsil C18柱（200 mm×4.6 mm，5μm）；流动相：甲醇∶0.02 mol／L磷酸二氢钾溶液（30∶70）；流速1.0 mL／min；柱温：25℃；进样量为10μL；紫外检测波长271 nm。理论板数按甲氧苄啶峰计算不低于2 500。

1.2.3 线性关系试验 精密称取甲氧苄啶对照品适量，加流动相溶解并稀释成0.2 mg／mL的对照品贮备液；精密量取该贮备液，用流动相溶液分别稀释制成10、20、40、80、160μg／mL 的待测液。依据1.2.2方法测定，记录峰面积，以峰面积（A）对质量浓度（C，μg／mL）进行线性回归。

1.2.4 精密度试验 取质量浓度为80μg／mL的甲氧苄啶标准品溶液，依据1.2.2方法测定，连续进样5次，记录峰面积。

1.2.5 稳定性试验 精密称取批号为201009027的甲氧苄啶原料药适量，加流动相溶解并稀释成约40μg／mL的溶液，摇匀。分别于0、10、20、30、40、60、90 min时，依据1.2.2方法测定，记录峰面积。

1.2.6 重现性试验 精密称取批号为201009036的甲氧苄啶原料药5份，依据1.2.3方法制备供试品溶液，并依据1.2.2方法，按照外标法进行甲氧苄啶含量测定。

1.2.7 加样回收试验 取已知质量浓度的供试品（批号为201010346）溶液，分为5份，分别精密加入甲氧苄啶标准品溶液（10.08μg／mL）1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，制备待测溶液，并依据1.2.2方法，按照外标法进行甲氧苄啶含量测定。

1.2.8 样品含量测定 取甲氧苄啶原料药及标准品适量，精密称量，加流动相制成每1 mL中含40 μg／mL的溶液，精密量取10μL注入色谱仪，记录色谱图。按外标法以峰面积计算含量。同时采用《中国兽药典》2010年版一部甲氧苄啶含量测定方法测定含量，然后将两种方法测定结果进行配对t检验。

2 结果

2.1 检测波长的选择

由图1可见甲氧苄啶在205 nm、271 nm波长处有最大吸收。考虑到200 nm附近有“边缘效应”，容易导致结果不稳定，故选择271 nm为测定波长。

图1 甲氧苄啶紫外吸收图谱Fig.1 UV of trimethoprim

2.2 色谱条件与系统适用性试验

由图2可知，甲氧苄啶的保留时间约为5.9 min，由高效液相化学工作站可以得出其理论板数大于3 000，故在此色谱条件下满足系统适用性试验。

图2 甲氧苄啶液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of trimethoprim

2.3 线性关系结果

按“1.2.3”项下方法，以峰面积（A）对质量浓度（C，μg／mL）进行线性回归，结果表明甲氧苄啶质量浓度在10μg／mL～160μg／mL范围内与峰面积呈良好的线性关系，检测数据及回归方程如表1所示。

2.4 精密度试验结果

按“1.2.4”项下方法得出，甲氧苄啶峰面积的RSD为0.73%（n＝5），峰面积见表2。表明该方法具有较高的精密度。

2.5 稳定性试验结果

按“1.2.5”项下方法得出，甲氧苄啶原料药峰面积的RSD为0.99%（n＝7），峰面积见表3。表明样品溶液在该体系下90 min内稳定。

表1 线性关系结果Table1 Results of linear relation

表2 精密度试验结果Table2 Results of precision tests

2.6 重现性试验

按“1.2.6”项下方法得出，其含量的 RSD 为0.66%（n＝5），含量见表4。表明方法重现性良好。

2.7 加样回收试验

按“1.2.7”项下方法，由表5结果可得出该方法加样回收率较高。

表3 稳定性试验结果Table3 The results of stability tests

2.8 两种含量测定方法测定结果

按“1.2.8”方法，由表6结果可得出两种方法测定结果无显著差异，表明这两种测定方法测定结果一致。

表4 重现性试验结果Table4 The results of reproducibility tests

表5 加样回收试验结果Table5 The results of recovery tests

表6 含量测定结果比较Table6 Comparison of determination results

高效液相色谱法测定甲氧苄啶的含量。色谱柱为Diamonsil C18柱（200 mm×4.6 mm，5μm），流动相为甲醇∶0.02 mol／L磷酸二氢钾（30∶70），流速为1.0 mL／min，柱温为25℃，检测波长为271 nm，流动相作为样品的稀释剂，进样量10μL。甲氧苄啶质量浓度在10μg／mL～160μg／mL范围内与峰面积呈线性关系，回归方程A＝0.389 2C－0.369 6，r＝0.999 9（n＝5）。

3 讨论

甲氧苄啶制剂中含量的测定方法有多种，罗兰等［6］、张桂枝等［7］采用了分光光度法，程志民等［8］采用了荧光分光光度法，宋慧敏等［9］、农毅清等［10］、魏京京等［11］、陈 玉 华［12］、郭时金 等［13］、陈庆伟等［14］、冯学忠等［15］《中国兽药典》2010年版［5］都采用高效液相色谱法进行了测定，但是对于甲氧苄啶原料药含量的测定，目前只有《中国兽药典》2005年版［4］和2010年版［5］上面的非水滴定法。非水滴定法测定过程中影响因素较多，存在测定结果不稳定的弊端。笔者采用高效液相色谱法对甲氧苄啶原料药含量进行测定，对该方法的线性关系考察、精密度试验、稳定性试验、重现性试验、加样回收试验等一系列试验，结果显示该方法稳定、精密度高、重现性较好、专属性强等优点，为今后能准确快速的测定甲氧苄啶的含量打下了基础。

随着兽药GMP的推进，兽药生产企业为了达到兽药GMP的认证标准，都购买了高效液相色谱仪，故高效液相色谱法测定甲氧苄啶含量的方法可以在兽药企业进行很好推广使用。

［1］中国兽药典委员会.兽药使用指南（化学药品卷）二〇一〇年版［M］.北京：中国农业出版社，2010：88.

［2］催一喆，王 新，韩铁锁.甲氧苄啶对白头翁体外抗菌增效作用及量效关系的试验 ［J］.中国兽医杂志，2010，46（9）：44－46.

［3］王 新，崔一喆，韩铁锁.甲氧苄啶对黄芩苷体外抗菌增效作用的试验 ［J］.中国兽医杂志，2010，46（11）：69－70.

［4］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇〇五年版一部［M］.北京：中国农业出版社，2005：50－51.

［5］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典二〇一〇年版一部［M］.北京：中国农业出版社，2010：53－54，392

［6］罗 兰，赖光超，曾常青.系数倍率法同时测定复方磺胺甲噁唑片中磺胺甲噁唑和甲氧苄啶的含量［J］.海峡药学，2010，22（9）：33－35.

［7］张桂枝，靳双星，焦喜兰.双波长分光光度法测定复方磺胺间甲氧嘧啶钠注射液中两主药的含量［J］.西北农业学报，2010，19（4）：21－23.

［8］程志民，齐正保，朱蔓菁.多元校正恒波长同步荧光法同时测定甲氧苄啶和诺氟沙星［J］.江西科学，2010，28（3）：301－303.

［9］宋慧敏，毕昊容，邵德佳，等.兽药粉剂／预混剂中甲氧苄啶的测定［J］.中国兽药杂志，2007，41（1）：33－35.

［10］农毅清，蒋 林，莫海玲.HPLC法测定复方磺胺甲噁唑糖浆中磺胺甲噁唑及甲氧苄啶的含量［J］.中国现代药物应用，2008，2（7）：1－3.

［11］魏京京，张启明，金少鸿.HPLC法测定联磺甲氧苄啶片的含量［J］.中国药事，2009，23（6）：565－567.

［12］陈玉华.头孢羟氨苄甲氧苄啶分散片的含量测定研究［J］.海峡药学，2010，22（7）：83－86.

［13］郭时金，沈志强，张志美，等.HPLC法检测磺胺间甲氧嘧啶钠和甲氧苄啶方法的研究［J］.家畜生态学报，2010，31（4）：73－76.

［14］陈庆伟，林小毅.高效液相法测定磷霉素钙甲氧苄啶胶囊中甲氧苄啶的含量［J］.海峡药学，2008，20（5）：41－42.

［15］冯学忠，黎华鹏，盘苑芷，等.HPLC同时测定复方二甲硝咪唑可溶性粉中地美硝唑、甲氧苄啶、磺胺对甲氧嘧啶的含量［J］.动物医学进展，2011，32（7）：55－60.