感染牛布鲁菌544A的巨噬细胞蛋白质组学分析

赵永坤，杨艳玲，孙春晖，郎需龙，王秀然，王景龙，张 瑞，王兴龙＊

（1.吉林农业大学，吉林长春130062；2.中国人民解放军军事兽医研究所 吉林省人兽共患病预防与控制重点实验室，吉林长春130062；3.中国农业科学院特产研究所，吉林132109）

布鲁菌病（Brucellosis）简称布病，是由布鲁菌（Brucella）引起的人兽共患传染病，严重危害畜牧业和人类健康。近年来，我国布鲁菌病疫情形势较为严峻，羊、牛布鲁菌病感染率呈上升趋势，而由病畜引起的人布鲁菌病的发病率也有了明显的上升［1－2］。

布鲁菌属于胞内寄生菌，主要寄生在巨噬细胞内。目前人们对该菌胞内寄生机制还不清楚［3－4］，这是人畜布鲁菌病难以防控的主要原因之一。

本研究利用比较蛋白质组学技术，对牛布鲁菌544A感染的巨噬细胞和未感染的巨噬细胞的全细胞蛋白进行了比较分析，对布鲁菌感染的和未感染的巨噬细胞的差异蛋白进行质谱鉴定和生物学信息分析，从而分析布鲁菌感染后巨噬细胞蛋白组分的变化，为进一步深入研究细菌与宿主相互作用的分子机制和胞内寄生的分子机制提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与细胞株 牛种布鲁菌强毒株544A购自中国兽医药品监察所。无菌条件下挑取在Tryptic soy agar（TSA）固体培养基上生长的牛布鲁菌强毒株544A的菌落加入到5 mL Tryptic soy broth（TSB）液体培养基中，在37℃、200 r／min条件下培养48 h。小鼠巨噬细胞系RAW264.7由吉林大学畜牧兽医学院韩文瑜教授惠赠，在无双抗的1 640培养基中常规培养。

1.1.2 主要试剂和仪器 IPG干胶条（18 cm，p H4～7，非线性）和IPG缓冲液（p H4～7，非线性）、2DQuant蛋白定量试剂盒、矿物油、二硫苏糖醇（DTT）、Tris、溴酚蓝等为GE－Healthcare公司产品；测序级胰蛋白酶为Roche公司产品；冰乙酸、无水乙醇、无水甲醇、甘油为国产分析纯；甲醛为优级纯；吸头与离心管为AXYGEN公司产品；等电聚焦仪（Ettan IPGphor Isoelectric Focusing System），垂直板电泳仪（Hofer SE 600），扫描仪（UMax Powerlook 2100XL），双向电泳凝胶图像分析软件（Image Master 2D Elite 6.0）均为GE－Healthcare公司产品；超速离心机（3K12，Nr12154）为Sigma公司产品。

1.2 方法

1.2.1 牛布鲁菌544A感染巨噬细胞模型的建立按照细胞与细菌1∶300的比例进行感染，感染后于37℃、体积分数为5%CO2的条件下培养2 h，然后用PBS洗3遍，加入2 mL含20 g／L双抗、100 mL／L胎牛血清的新鲜细胞培养液，然后每孔加入30μg／mL的庆大霉素6μL［5－7］，继续培养2.5 h，经免疫荧光试验和透射电镜观察此时细菌已经完全入侵到细胞内，将此时建立起的布鲁菌感染巨噬细胞模型作为进一步提取蛋白使用。

1.2.2 感染巨噬细胞全蛋白的提取 参照高永辉［5］的方法，将制备好的感染布鲁菌的巨噬细胞以1 500 r／min离心10 min，将收集的细胞用预冷的低盐PBS（3 mmol／L KCl，1.5 mmol／L KH2PO4，68 mmol／L NaCl，9 mmol／L Na H2PO4）洗细胞3次，1 500 r／min离心10 min收集细胞到1.5 mL低吸附的EP管中。然后加入0.7 mL超声裂解液（含蛋白酶抑制剂），冰浴超声2 min～5 min（SONICS VC 750，小探头，最大功率的25% ，脉冲2 s，停2 s）。室温放置1 h以上，让蛋白质充分溶解。45 000 r／min离心1 h，去除不溶性沉淀，取上清用2－D Quant Kit测定蛋白质浓度。同种方法提取相同数量未感染的巨噬细胞的全蛋白，并定量，置－70℃保存，用于蛋白质组学分析。

1.2.3 双向电泳 参照 Görg A 等［6］描述的双向电泳方法略加改进。将制备的感染布鲁菌的巨噬细胞全蛋白50μL（800μg），加入1.75μL IPG buffer以及水化液至终体积350μL，Vortex混匀，室温放置30 min，在10℃以13 000 r／min离心1 h；吸取上清平铺被动水化盘中，将预制的18 cm、p H4～7的IPG胶条缓慢从酸性端一侧剥去IPG胶条的保护膜，胶面朝下，缓慢放入水化槽中，注意避免生成气泡，要使水化液浸湿整个胶条，并确保胶条两端与电泳槽两端的电极接触；IPG胶条上覆盖2 mL矿物油，盖上盖子，常温下水化20 h；将胶条转移到胶条槽上，胶面朝上，在胶条的两端加上电极纸片（Amersham Pharmacia公司产品），夹上电极，保证充分的接触，覆盖4 mL矿物油，盖上盖子。设置IPGphor仪器运行参数开始等电聚焦（50 V 2 h，500 V 1 h，1 000 V 1 h，3 000 V 3 h，8 000 V 3 h ，8 000 V聚焦至48 000 V 3 h。电流50μA／胶条，20℃）。将等点聚焦结束后的胶条进行2次平衡，先把胶条放入10 mL含10 g／L DTT的平衡缓冲液中，在水平摇床上缓慢摇动平衡15 min；移出胶条，在10 mL含25 g／L碘乙酰胺的平衡缓冲液中再平衡15 min。将平衡好的胶条在预先配置好的浓度为120 g／L的SDS－PAGE凝胶中进行分离，采用恒功率方式电泳，12℃循环水浴冷却。先在功率为1 W／gel条件下电泳30 min后，当溴酚蓝移出胶条后再将功率加大至12 W／gel，当溴酚蓝移到凝胶底部时中止电泳，用银染的方法对电泳凝胶进行染色分析。

1.2.4 图像扫描和分析 分别将牛布鲁菌强毒株544A感染和未感染的巨噬细胞全蛋白分离的两组凝胶（每组3块凝胶）扫描后，用Image Master 2D Platinum双向电泳凝胶图像分析软件进行对比分析，寻找差异表达的蛋白点。蛋白质点的分子质量根据电泳时加入的预染标准蛋白Marker的位置而确定，等电点根据所用IEF胶条的p H范围计算。根据软件获取每个蛋白点的丰度值，挑选表达丰度差异在2倍以上的蛋白点作为差异点。

1.2.5 胶内酶切及MALDI－TOF质谱检测 将差异蛋白点从凝胶上挖取下来，装在含100μL去离子水的离心管里，寄往上海生命科学院进行胶内酶切和MALDI－TOF质谱鉴定。

1.2.6 数据分析 根据质谱鉴定所提供的相关数据进行差异蛋白相关数据的检索，并主要对这些差异蛋白的功能进行了分析。

2 结果

2.1 牛布鲁菌感染巨噬细胞的透射电镜观察

根据透射电镜观察所需的步骤处理牛布鲁菌544A感染4.5 h的巨噬细胞，牛布鲁菌在感染后4.5 h可以通过透射电镜清楚地观察到细胞内的细菌（图1）。

图1 布鲁菌感染巨噬细胞后的电镜观察Fig.1 The electron microscope observation Brucella of macrophages with infected

2.2 牛布鲁菌感染巨噬细胞的间接免疫荧光检测

用豚鼠抗牛布鲁菌的阳性血清和FITC偶联的兔抗豚鼠IgG分别作为一抗和二抗，对感染后4.5 h的巨噬细胞进行免疫荧光检测，观察布鲁菌对巨噬细胞的感染情况。细胞内出现明显的荧光，说明布鲁菌已经侵入到细胞内（图2）。

图2 布鲁菌感染巨噬细胞后的免疫荧光检测Fig.2 The immunofluorescence detection of Brucella infected macrophages

2.3 感染牛布鲁菌强毒株544A和未感染巨噬细胞的双向电泳图谱

感染布鲁菌和未感染布鲁菌的巨噬细胞全细胞蛋白经过双向电泳分离，结果如图3A和3B所示，蛋白点在p H4～7范围内分布比较集中，每个样品经过6次重复，用Image Master 2D Platinum 双向电泳凝胶图像分析软件进行对比分析后，结果有13种蛋白差异表达，差异表达的蛋白被分别标记在图3A和3B中。

图3 巨噬细胞感染布鲁菌后的全细胞蛋白的差异表分析Fig.3 The macrophage Brucella infected whole－cell protein analysis of the difference types

2.4 差异蛋白的质谱鉴定和生物学信息检索结果

通过生物学信息分析，13个差异蛋白点代表了12种蛋白质。这些蛋白质主要与细胞的代谢、细胞骨架合成、蛋白损伤修复以及基因的转录调控等生物过程密切相关。

2.4.1 磷酸丙糖异构酶（triosephosphate isomerase，TPI） 在糖酵解过程中发挥重要的作用，是最有效的能量物质。

2.4.2 锌指蛋白2（zinc finger protein 2） 锌指蛋白是一类具有手指状结构域的转录因子，在基因调控中起着重要的作用，具有广泛的生物功能，如DNA识别，RNA包装，转录及转录后调控，蛋白折叠和装配，参与肿瘤的形成且与机体免疫系统密切相关等。

2.4.3 半胱氨酸蛋白酶抑制剂 （cystatin－B）Cystatin－B蛋白在人类被CSTB基因编码，缺失可能与人类的进行性肌阵挛性癫痫发生有关。

2.4.4 延伸因子2（elongation factor 2，EF2） 蛋白质延长过程中起作用的GTP水解酶。

2.4.5 天冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST） AST是氨基酸代谢过程中重要的酶，其升高与细胞的损伤和坏死相关。

2.4.6 酸性核磷酸蛋白pp32（acidic nuclear phosphoprotein pp32） 是一种富含亮氨酸的酸性核蛋白，在细胞增殖，凋亡m RNA转运，信号转导和细胞骨架动力学等多种生物过程发挥重要的作用。

2.4.7 protein 71 ku热休克同源蛋白（heat shock cognate 71 ku） 作为转录激活的阻抑物，阻止转录辅激活因子CITED1在Smad介导的转录上的活性。

2.4.8 铁蛋白轻链1（ferritin light chain 1 FTL）是铁蛋白的一种亚基，是细胞内主要的铁储存蛋白。储存机体中的过剩铁，避免产生铁中毒和释放铁给需铁的细胞，用于体内生物合成含铁的蛋白质或酶，对铁离子的自身稳定起到重要的作用。

2.4.9 铁蛋白轻链1（ferritin light chain 1 FTL）是铁蛋白的一种亚基，是细胞内主要的铁储存蛋白。储存机体中的过剩铁，避免产生铁中毒和释放铁给需铁的细胞，用于体内生物合成含铁的蛋白质或酶，对铁离子的自身稳定起到重要的作用。

2.4.10 26 S蛋白酶－非ATP酶（26 S proteasome，non－ATPase subunit） 与肝细胞癌密切相关。

2.4.11 细胞质型苹果酸脱氢酶（cytosolic malate dehydrogenase） 苹果酸脱氢酶普遍存在于各种生物中，它负责催化草酰乙酸和苹果酸之间的相互转换。根据其辅酶的特异性和在细胞内的分布和生理功能的不同。

2.4.12 亚砷酸盐甲基化转移酶（arsenite methyltransferase） 参与体内砷的甲基化过程。

2.4.13 5－β微管蛋白（tubulin beta－5 chain） 是微管的主要成分，构成细胞骨架的结构成分，结合2分子的GTP。

3 讨论

布鲁菌感染后主要寄生在巨噬细胞内，并可以逃避巨噬细胞的吞噬并在巨噬细胞内繁殖，这是布鲁菌致病的主要机制［5－6］。为进一步了解布鲁菌的致病机制，本研究从布鲁菌感染的和未感染的巨噬细胞本身所发生的蛋白变化的角度，对布鲁菌感染后所引起的巨噬细胞蛋白质组成所发生的改变进行深入研究，从而为揭示布鲁菌在宿主细胞内的寄生机制提供依据。

牛布鲁菌544A是国际标准的牛种布鲁菌强毒株，侵入机体后在宿主细胞内寄生，并引起机体发病。为此，本研究建立了牛布鲁菌感染巨噬细胞的模型，根据透射电镜和免疫荧光观察结果显示布鲁菌已经侵入巨噬细胞内。进而利用2－DE技术和蛋白质谱鉴定相结合的方法来比较分析牛布鲁菌544A感染的和未感染的巨噬细胞的蛋白质组变化，结果共确定了13个差异点，对应12个蛋白质编码基因。通过对这些蛋白的生物学信息进行检索，发现它们主要参与了细胞的代谢、细胞骨架合成、蛋白损伤修复以及基因的转录调控等生物过程。

布鲁菌在胞内寄生，需要消耗细胞的能量来完成其在胞内的运输和繁殖，同时布氏小体内表现出营养缺乏和微需氧，相应的在这些参与运输和复制“温室”中长期生存和复制过程中也需要布鲁菌做大量的代谢改变［7］。为此，本研究中发现与糖酵解、能量代谢、离子运输相关的酶发生了表达上的改变，如TPI、MDH、ferritin light chain 1 等，这些蛋白在表达上的改变与布鲁菌在细胞内寄生机制相一致，提示这些蛋白也可以作为抗布鲁菌入侵的靶蛋白进行深入的研究。

此外，布鲁菌强毒株能在宿主细胞内存活并大量繁殖，另外一个主要的因素是布鲁菌抑制吞噬体（phagosome）的成熟，使吞噬了布鲁菌的巨噬细胞丧失正常的功能，不能与溶酶体正常融合，从而产生一个具有内吞体性质而非溶酶体性质的有益于细菌在细胞内生存的酸性空间——布氏小体［8－10］。文献报道［11］，布鲁菌强毒株侵袭巨噬细胞后在布鲁菌抑制吞噬体成熟的过程中，布鲁菌抑制了宿主细胞内与凋亡和细胞周期有关的基因，本试验结果表明，强毒株感染后与细胞凋亡、损伤相关的蛋白都发生了改变（如酸性核磷酸蛋白pp32、26S proteasome、non－ATPase和AST等），进而证明了上述观点。

布鲁菌感染后宿主细胞会有氧化应激反应的发生，这将会导致细胞内许多生物大分子（蛋白质、核酸等）的结构和功能发生损伤，为了维持蛋白质等大分子的正常结构、功能和细胞的生理功能，热休克蛋白（HSP）等分子伴侣表达上调，71 ku热休克同源蛋白、elongation factor 2、zinc finger protein 2等帮助蛋白修复和折叠的分子表达升高，以恢复变性蛋白的功能。

布鲁菌强毒株感染宿主细胞是一个复杂的生物反应过程，并且导致细胞多个系统的功能和结构都发生了改变，尤其是宿主细胞的骨架结构、信号转导、能量代谢方式、细胞损伤后的修复等都发生了很大的变化。为此，上述这些方面发生改变的蛋白质都将成为我们今后研究布鲁菌在宿主细胞内寄生机制的靶蛋白，它们的过表达或抑制能否帮助宿主细胞抵抗布鲁菌的入侵需要进一步研究。同时由于双向电泳技术自身的缺陷［12］，相对于细胞内蛋白质组的上万种蛋白质来说，我们也只能粗略的对细胞内的部分蛋白质进行分析，一些差异蛋白可能未被鉴定出来，这些技术都需要进一步改善。

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