口服BSA免疫对鸡盲肠扁桃体组织结构变化的影响

任清丹，杨树宝，于玉芬，文学忠，袁 陆，杨丽华，栾维民＊

（1.吉林省畜牧兽医科学研究院，吉林长春130062；2.吉林农业大学动物科技学院，吉林长春130118；3.吉林农业大学发展学院，吉林长春130600）

盲肠扁桃体（caecal tonsil，CT ）是禽类消化道中最大免疫组织，位于回－盲－直肠连接部，较为发达，肉眼可看见略有膨大，CT固有层和黏膜下层中富含弥散性的淋巴集结，其内有小淋巴细胞、成熟和未成熟的浆细胞［1］。淋巴集结内含有较大的生发中心，是合成抗体非常重要的场所，对肠内细菌还有其他抗原物质起到局部免疫应答作用。CT内的淋巴细胞包括45%～53%的B淋巴细胞，大约34%的T淋巴细胞，这些淋巴细胞既参与抗体的产生，也参与细胞介导的免疫功能［2］。研究鸡盲肠扁桃体发育及其免疫功能的发生，从而了解鸡出壳后生长初期的免疫状态，为禽类的适时免疫和疾病防治提供理论基础，对免疫学的发展具有重要的理论和现实意义［3］。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 仪器 Image－proexpress 5.1图像分析软件（美国 Media Cybernetics公司）；依爱 EIF／C.DME 3456孵化机／出雏机，Leica CM 1850冰冻切片机，Olympus CX41显微镜，Pixera pro 150ES图像采集器。

1.1.2 试剂 冰冻切片用OCT组织包埋液（美国Sakura）APES，DAB显色液，丙酮，酒精，二甲苯为北京化工厂产品；苏木精，伊红为中国医药上海化学试剂公司产品。

1.1.3 试验动物 海兰白鸡，其种蛋为长春净月潭开发区银河养殖场孵化雏鸡。

1.1.4 免疫原 牛血清白蛋白（BSA）为北京鼎国生物技术有限公司产品。

1.2 方法

1.2.1 动物免疫接种 新生小鸡饲养于用甲醛－高锰酸钾熏蒸消毒的动物房中，将雏鸡分为免疫组和对照组，每组50只，对免疫组雏鸡进行定时空腹口服免疫，每只鸡口服1 mL浓度为10 mg／mL BSA，连续口服免疫6 d。在最后一次免疫后的1、4、7、10、13、16、19、22、25、28 d分别随机选取4只鸡，取其盲肠扁桃体。对照组也在各免疫组取材相同的日龄时取相同部位的组织，用OCT组织包埋液包埋，放在－80℃冰箱保存备用。

1.2.2 冰冻切片 将放在－80℃冰箱备用的鸡的盲肠扁桃体组织取出，用冰冻切片机，制成厚度为5 μm的组织切片，以进行HE染色。

1.2.3 HE染色方法 向粘贴于载玻片上的盲肠扁桃体组织滴加5 g／L火棉胶2滴，自然干燥约2 min后，100 mL／L甲醛固定30 s；蒸馏水洗2次，每次2 min；苏木素染色10 min；自来水蓝化；10 mL／L盐酸酒精分化30 s；自来水返蓝；伊红复染1 min；850 mL／L酒精10 s；950 mL／L酒精10 s；乙醚－酒精1 min，脱去火棉胶；酒精固定2次，每次30 s；二甲苯固定2次，每次30 s；封固后照相。

1.2.4 统计分析 HE染色照相后，采用Imagepro express 5.1图像分析软件对每张盲肠扁桃体HE染色照片里的肠绒毛长度、皱褶高度和肠腺深度和生发中心直径进行测定，每张切片测5个视野，而后求平均值，所得数据用（¯X±SD）表示，对不同日龄的鸡盲肠扁桃体的肠绒毛长度、皱褶高度和肠腺深度和生发中心直径进行差异的显著性检验。统计数据用Spss13.0软件进行统计学处理。

2 结果

2.1 7日龄时鸡盲肠扁桃体组织结构的发育

免疫组和对照组鸡7日龄时，肠绒毛增长并逐渐变粗，细胞排列较紧密，肠腺较为明显。黏膜结构也发生了较大的变化，肠绒毛的固有层明显增厚且变宽，绒毛互相融合在一起形成大的黏膜皱襞，免疫组比对照组皱襞明显增加，差异显著（P＜0.05）（图1～图2）。

图1 免疫组7日龄（HE×100）（箭头：黏膜皱襞）Fig.1 7－day－old immune group（HE×100）（arrow：mucosal folds）

2.2 16日龄时鸡盲肠扁桃体组织结构的发育

免疫组和对照组16日龄时鸡的盲肠扁桃体中均能观察到有网状细胞包裹的形态完整的生发中心，免疫组生发中心数量和直径明显大于对照组生发中心数量和直径，差异显著（P＜0.05）（图3～图4），生发中心大多数分布在黏膜层的中下部区域，多为卵圆形，四周包围结缔组织形成的被膜，免疫组生发中心与周围组织界限清楚，常单独存在，少数可见聚集成群，着色较深。对照组生发中心明显较小，边缘不整齐与周围组织的界限不清，淋巴滤泡形成较少，着色暗淡，随着鸡日龄的增长，免疫组和对照组的鸡盲肠扁桃体中生发中心的数量逐渐增多，直径明显增大，肠腺深度和皱襞高度也都明显增大（表1）。

图2 对照组7日龄（HE×100）（箭头：黏膜皱襞）Fig.2 7－day－old control group（HE×100）（arrow：mucosal folds）

图3 免疫组16日龄（HE×100）（箭头：生发中心）Fig.3 16－day－old immune group（HE×100）（arrow：germinal center）

图4 对照组16日龄（HE×100）（箭头：生发中心）Fig.4 16－day－old control group（HE×100）（arrow：germinal center）

表1 不同日龄鸡盲肠扁桃体（免疫组和对照组）组织结构变化情况Table1 The histological changes in caecal tonsil of different old－age chickens（control group and immune group）

3 讨论

研究显示，免疫组盲肠扁桃体中的生发中心数量比对照组盲肠扁桃体中生发中心数量多，而且生发中心直径比对照组生发中心直径长。免疫组肠腺深度和黏膜皱褶厚度都比对照组肠腺深度和黏膜皱褶厚度都有明显增加，并且在22日龄～28日龄时，免疫组与对照组相比差异显著（p＜0.05），出现这种情况的原因可能是因为口服免疫T细胞依赖性抗原后刺激盲肠扁桃体内各个组织结构均发生了较大变化，增强了鸡的免疫功能。对照组中，随着鸡日龄的增加，盲肠扁桃体中的生发中心数量不断增加，盲肠扁桃体特征结构也在不断发育，并在25日龄后达到成熟状态，这与张立世等［4］研究结果不一致，他们认为鸡在21日龄时组织结构就基本达到成熟水平，我们的结果是在25日龄时盲肠扁桃体组织结构达到成熟水平。而Jeurissen S H 等［5］用组织学方法在14日龄时未发现生发中心的存在，这一结果与本研究相同，我们用HE染色观察14日龄时鸡的盲肠扁桃体，也未发现生发中心的出现，但在16日龄时观察到盲肠扁桃体中有由B淋巴细胞聚集的生发中心。到19日龄后观察到轮廓更为清晰的生发中心，这一结果与Gomez D M 等［6］报道的4日龄时鸡盲肠扁桃体中出现生发中心，以及Hoshi H等［7］报道的14日龄时盲肠扁桃体中出现生发中心的结果存在差异。这可能是由于试验条件和试验动物的差异所造成的。在外周淋巴组织中，生发中心是由抗原刺激产生的，因此鸡盲肠扁桃体中生发中心出现的时间及数量，很大程度上受到肠道中正常菌群出现的时间、数量以及有无感染等因素的影响，此外，鸡的品种、免疫方法和免疫程序、饲养条件等也都可以成为影响生发中心出现时间和数量的重要影响因素。

［1］鲍恩东，陈万芳.鸡胚免疫系统器官组织学变化观察［J］.中国兽医科技，1996，2（26）：26－27.

［2］余锐萍，陈 越.日粮锌粞水平对肉鸡盲肠扁桃体结构的影响［J］.中国兽医杂志，2004，40（7）：10－12.

［3］朱国强，王永坤.禽免疫系统的结构与功能［J］.预防兽医学进展，2001，3（1）：27－30.

［4］张立世，杨树宝，姜云垒，等.鸡盲肠扁桃体组织结构早期发育的动态观察［J］.家禽科学，2011，4（23）：1673－1085.

［5］Jeurissen S H，Janse E M，Koch G，et al.Postnatal development of mucosa－associated lymphoid tissues in chickens ［J］.Cell Tissue Res，1989，258 （1）：119－124.

［6］Gomez D M，Fonfria J，Varas A，et al.Appearance and development of lymphoid cells in the chicken caecal tonsil［J］.Anat Rec，1998，250（2）：182－189.

［7］Hoshi H，Mori T.Identification of the bursa－dependent and thymus－dependent areas in the tonsilla caecalis of chickens［J］.Tohoku J Exp Med，1973，111（4）：309－322.