胃腺癌组织中Cks1和p27kip1表达的关系及其预后价值

王启船 王 青 万里新 屈中玉 盛 晶 (南阳市中心医院肿瘤内科，河南 南阳 473009)

浸润和转移是胃腺癌发生发展过程中重要环节，此过程受基因和蛋白多重调控〔1〕。p27kip1蛋白是新近发现的与细胞周期调控相关的重要基因，其表达的蛋白参与细胞增殖、分化和凋亡过程。降解是由Skp2完成的，Skp2只有结合细胞周期蛋白激酶亚单位1(Cyclin kinase subunit 1，Cks1)才能识别p27kip1并进行泛素化降解，p27kip1和Cks1在肿瘤发生发展过程中存在一定相关性，Cks1是高度保守的细胞周期调节蛋白，其可以对p27kip1进行泛素化蛋白降解作用〔2〕。本实验拟探讨胃腺癌组织Cks1和p27kip1表达关系及对预后的判断意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料 我院2006年1月至2008年2月胃腺癌手术后预留的新鲜冻存组织，均符合WHO关于胃腺癌的诊断标准。排除标准:①术前行放、化疗;②临床资料不完整;③合并其他恶性肿瘤。胃腺癌组97例，其中男50例，女47例，年龄42～76(平均58.7)岁。选择距离肿瘤大于5 cm胃腺癌手术切缘的正常胃黏膜组织48例为对照组，其中男25例，女23例，年龄42～74(平均57.4)岁。两组一般临床资料无统计学差别。

1.2 流式细胞学检测 Cks1和p27kip1蛋白均购自武汉博士德生物技术有限公司，正式检测前均进行预实验，应用不同比例稀释，摸索最佳比例用于实验。从冰箱中取出冻存新鲜标本约60 g，置于70%的酒精中固定2 d后取出，在不锈钢网上轻搓并用生理盐水冲洗，搓尽后去残渣。取混悬液，采用铜网过滤后留取细胞悬液，离心2 min后，制备成单细胞悬液1×106/ml，取1 ml，分别加入稀释后的Cks1和p27kip1蛋白一抗，在室温中放置30 min，加入PBS 10 ml洗涤一次，弃上清，加入FITC-IgG二抗，避光室温放置30 min，加入PBS 10 ml后离心，弃上清。加入PBS 0.1 ml，过滤后采用美国BC公司的流式细胞仪检测。同时设用PBS代替一抗和二抗的阴性对照，以及只加一抗或二抗的阳性对照〔3〕。应用 Expo 32 ADC进行免疫荧光数据的分析。

1.3 流式细胞的结果判断 应用荧光指数(FI)表示Cks1和p27kip1蛋白表达量〔4〕。

1.4 统计学处理 采用SAS6.12软件进行两组间t、χ2检验和线性相关性分析及生存分析。

2 结果

2.1 Cks1和p27kip1蛋白在胃腺癌及正常胃黏膜中表达比较胃腺癌组Cks1(1.34±0.23 vs 1.00±0.23)和p27kip1蛋白表达量(0.84±0.21 vs 1.00±0.16)与正常胃黏膜组有显著差异(t=7.64，P=0.003 2;t=5.46，P=0.010 3)。

2.2 Cks1和p27kip1蛋白表达与胃腺癌临床病理特征的关系胃腺癌中Cks1和p27kip1蛋白表达量与浸润深度、TNM分期、PCNA表达及淋巴结转移密切相关。见表1。

表1 Cks1和p27kip1蛋白表达与胃腺癌临床病理特征的关系

2.3 胃腺癌中Cks1和p27kip1蛋白表达相关性 经线性相关分析显示，胃腺癌中Cks1和p27kipl蛋白表达呈负相关(r=－0.44，P=0.045 1)。

2.4 胃腺癌中Cks1和p27kip1蛋白表达与预后的关系 随访8～48(平均26.8)个月。胃腺癌中 Cks1(χ2=10.11，P＜0.05)和 p27kip1蛋白(χ2=9.96，P＜0.05)表达与患者预后相关，即Cks1高表达、p27kip1蛋白低表达的患者预后差。

3 讨论

在胃腺癌进展过程中，生长与扩散是重要的生物学行为，此过程中，基因和蛋白改变起重要作用。而且恶性肿瘤细胞与宿主细胞间相互作用是一个复杂、多步骤过程，此过程与肿瘤细胞黏附力、运动能力、增殖能力和细胞周期调节有明显关系〔1〕。Cks1基因位于人类染色体8q21，其序列全长717 bp，其中有编码作用的碱基为240 bp，编码79个氨基酸，相对分子质量约为9×103。Cks1蛋白有3种结合位点，即Skp2结合位、Cdk结合位和阴离子结合位，这3种结合位点在SCFSkp2泛素化降解p27的过程中发挥重要作用〔4〕。

本结果提示Cks1、p27kip1在胃腺癌形成过程中起重要促进作用，二者可能参与肿瘤浸润、生长、增殖和淋巴结转移，由于以上因素均与肿瘤预后相关，而生存分析直接证实了Cks1和p27kip1蛋白对预后的判断价值，因此二者联合检测可能有助于判断患者预后。由于胃腺癌中Cks1和p27kip1蛋白之间均呈负相关性，提示Cks1和p27kip1蛋白二者之间可能存在着通路作用，即二种蛋白形成独立的作用途径，其作用机制可能为Cks1作为上游蛋白，调节p27kip1蛋白表达，也可能以Skp2为中介蛋白进行调节，形成蛋白和基因的连锁反应。Cks1可促进泛素化Cyclin-Cdk过程，进而抑制 p27kip1蛋白泛素化降解〔5〕。而p27kip1可对细胞周期进行负调节，并抑制相关蛋白和激酶活性。p27kip1就是通过对cyclinE/D-CDK2的抑制而使细胞生长繁殖时停滞在G1期，实现调节作用，进而抑制细胞增生并促进细胞凋亡，抑制肿瘤细胞生长和繁殖〔6〕。Cks1蛋白可有效促进p27kip1蛋白泛素化降解，使得p27kip1蛋白在细胞调控中的作用减弱，从而促进肿瘤发生发展。但是近年有研究显示Cks1蛋白参与并促进p27kipl蛋白泛素化降解必须具备4个条件:①由Cyclin E/A-CDK2促使p27kip1蛋白第187位苏氨酸磷酸化过程。②Skp2在结构中的改变。③Cks1蛋白与Skp2连接后，使Skp2结构域构象发生改变，并且有利于Skp2与Skp1稳定结合。④Cks1、Skp2、周期蛋白依赖激酶复合物的相对稳定。也有研究显示Cks1可能对基质金属蛋白酶有调节作用〔7〕，破坏基底膜，促使肿瘤细胞离开原发病灶进入淋巴循环或血液循环中，引起全身转移。因此关于Cks1和p27kip1的调节作用及机制可能是多元性的，需要更多基础实验来证实。

1 刘爱东.Kiss-1在胃癌中的表达及意义〔J〕.现代中西医结合杂志，2011;20(19):2354-5.

2 Wang XC，Tian LL，Tian J，et al.Overexpression of Cks1 increases the radiotherapy resistance of esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.J Radiat Res，2012;53(1):72-8.

3 刘爱东，刘士生，许志萍，等.E-cadherin在胃癌中的表达及意义〔J〕.广东医学，2007;28(11):1806-7.

4 Lee EK，Kim DG，Kim JS，et al.Cell-cycle regulator Cks1 promotes hepatocellular carcinoma by supporting NF-κB-dependent expression of interleukin-8〔J〕.Cancer Res，2011;71(21):6827-35.

5 Shen DY，Fang ZX，You P，et al.Clinical significance and expression of cyclin kinase subunits 1 and 2 in hepatocellular carcinoma〔J〕.Liver Int，2010;30(1):119-25.

6 Nagler RM，Ben-Izhak O，Ostrovsky D，et al.The expression and prognostic significance of Cks1 in salivary cancer〔J〕.Cancer Invest，2009;27(5):512-20.

7 陈紫萱，黄如欣，张忠英，等.CKS1蛋白在恶性肿瘤中的研究进展〔J〕.检验医学与临床，2009;6(9):705-6.