猪GPAT基因SNPs位点分析和表达规律的研究

杨俊静，李海涛，张冬杰，杨秀芹，刘 娣,*

（1.东北农业大学动物科学技术学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江省农业科学院畜牧研究所，哈尔滨 150086）

近年来，我国畜禽育种取得巨大进展，但在注重生长性能的同时，肉质的品质却不能得到保障。随着生活水平的提高，人民更希望能吃到天然、味美、健康的肉类产品，所以对优质猪肉品质性状的选育尤为重要。肉质鲜味特性的主要物质基础是由肌苷酸（Inosine monophosphate，IMP）、氨基酸（谷氨酸和甘氨酸）和肌内脂肪所决定的，国际上大多以肌苷酸的含量作为肉类新鲜程度的指标[1]。谷氨酰胺磷酸核糖焦磷酸酰胺转移酶（GPAT）是催化次黄嘌呤核苷酸合成过程的一种限速酶，催化次黄嘌呤合成的第一步反应，是影响肌苷酸生成的、决定肉质性状的候选基因[2]。猪GPAT基因位于2号染色体上，DNA序列全长68 763 bp，包含21个外显子，编码826个氨基酸。先后在人[3]、鼠[4]、鸡[5]上被克隆出来。本研究对民猪GPAT基因进行了克隆测序，并通过PCR-SSCP的方法对GPAT基因在民猪、野猪、北京黑猪、大白猪、长白猪和杜洛克间进行多态性研究，探讨不同品种猪之间风味特性的差异与GPAT基因的关系，为寻找与猪肉风味品质性状紧密连锁的有效分子遗传标记奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

长白猪105头、大白猪77头、杜洛克均来自东北农业大学原种猪培育中心；北京黑猪40头来自小岭猪场；民猪33头来自黑龙江省兰西种猪场；野杂猪8头来自黑龙江省农科院畜牧所养殖基地。

1.2 方法

1.2.1 样品的采集、基因组DNA和总cDNA的制备

民猪、北京黑猪、大白猪、长白猪、野猪、杜洛克6个猪种的基因组DNA样品为本实验室保存样品。屠宰了3头民猪，采集背肌、卵巢、大肠、肺、肝脏、脾、肾、腿肌、胃、小肠、心脏、子宫共12种组织器官样品。按照Trizol Reagent总RNA提取试剂盒操作说明分别提取这12种组织的总RNA，利用1.4%变性琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的质量，按照TaKaRa公司生产的PrimeScript RT reagen Kit试剂盒说明书方法将RNA反转录成cDNA。

1.2.2 引物的设计

根据GenBank上发表的猪GPAT基因的DNA序列（XM_001927875.1）设计引物，分别对第1外显子、第9外显子、第14外显子和第18外显子进行扩增和多态性分析；根据GPAT基因的mRNA序列设计Real-time PCR扩增引物C1、C2，引物的相关信息见表1。

表1 引物相关信息Table1 Information of Primers

1.2.3 多态性检测

以民猪、北京黑猪、大白猪、长白猪、野杂猪、杜洛克共278头个体DNA为模板；进行PCR-SSCP反应，凝胶浓度为18%；电泳结束后，进行银染，显色。

1.2.4 Real time-PCR反应体系的建立

根据宝生物工程（大连）有限公司的SYBR，Premix Ex TaqTM II试剂盒构建20 μL反应体系，采用两步法反应，每个样本重复3次，根据标准曲线以及荧光曲线Ct值计算定量结果。

1.2.5 标准曲线的绘制

分别取已制备的猪12种组织cDNA样品（50 ng·μL-1）各1 μL进行混合，利用宝生物工程（大连）有限公司的EASY Dilution试剂按10倍浓度梯度稀释为5 ng·μL-1、500 、50、5、0.5 pg·μL-1。分别取2 μL，对1～100 ng的cDNA制作标准曲线。

1.2.6 数据分析

BLAST方法进行同源性比对，使用SPSS软件进行t检验和χ2检验、用PIC-Calc 0.6软件进行PIC值计算。

2 结果与分析

2.1 PCR-SSCP检测结果

在所检测的4个外显子中，第1外显子和第14外显子中各存在一处多态。P1F/R引物的扩增产物经PCR-SSCP检测后，共发现三种基因型，两种纯合型分别命名为AA、BB。对两种纯合型个体进行克隆测序发现，A等位基因在151、171 bp处的核苷酸分别为T、G；B等位基因分别为C、T（见图1），151 bp处突变使苯丙氨酸变为亮氨酸。P3F/R引物的扩增产物经PCR-SSCP检测后，共发现三种基因型，两种纯合型分别命名为CC、DD。对两种纯合型个体进行克隆测序发现，A等位基因在1 937 bp处的核苷酸分别为G；B等位基因分别为T（见图2），并引起亮氨酸变为精氨酸。

图1 P1F/R引物PCR-SSCP电泳图谱Fig.1 PCR-SSCP electrophoresis pattern of P1F/R primer

2.2 群体遗传学分析

针对以上PCR-SSCP检测结果，分析各基因型在北京黑猪、长白猪和大白猪等6个猪种中的分布规律。GPAT基因第1外显子、第14显子处各品种的检测个体数、基因型频率、基因频率、多态信息含量（PIC）等统计参数值分别见表2和表3。

图2 P3F/R引物PCR-SSCP电泳图谱Fig.2 PCR-SSCP electrophoresis pattern of P3F/R primer

表2 不同品种猪GPAT基因的第1外显子基因型频率和基因频率Table2 Allele ferquencies and genotype frequencies of GPAT among different swine hreeds

表3 不同品种猪GPAT基因的第14外显子基因型频率和基因频率Table3 Allele ferquencies and genotype frequencies of GPAT among different swine hreeds

χ2独立性检验表明在所检测的各多态位点，不同基因型在民猪、北京黑猪、长白猪和大白猪等品种间的分布存在显著差异（P＜0.01）。第1、14外显子多态的χ2分割检验结果见表4和表5。

表4 GPAT基因第1外显子SNP位点在不同群体中的基因型分布的χ2检验Table4 Chi-square testing of GPAT gene for genotype distribution of SNPs between breeds

表5 GPAT基因第14外显子SNP位点在不同群体中的基因型分布的χ2检验Table5 Chi-square testing of GPAT gene for genotype distribution of SNPs between breeds

2.3 Real-time PCR定量检测民猪12种组织中GPAT基因的表达

结果见图3。由图3可以看出各组织表达谱及统计分析结果，发现经过内参β-actin对猪12种组织中GPAT基因表达量的校正，发现GPAT基因在肝脏中表达量较高，按照表达量从高到低依次为：肝脏＞大肠＞卵巢＞脾＞胃＞肾脏＞小肠＞肺＞心脏＞腿肌＞背肌＞子宫。

图3 民猪12种组织中GPAT基因的表达情况Fig.3 Expression of GPAT in 12 kinds of tissues of Min pig

3 讨论与结论

肌苷酸已逐渐成为衡量肉质鲜味的一个重要指标，在各个品种内及品种间肌苷酸的含量也呈现很大的差异。Chow I S等用薄层层析法测定了鸡中肌肉中肌苷酸的含量，发现品种、性别、日龄及组织等对肌苷酸含量有不同程度的影响[6]，随后也有大量的研究表明不同物种在同样的条件下所形成的肌苷酸的含量差异很大，肌肉肌苷酸的含量也随年龄和体重的增加而逐渐减少等[7]。肌苷酸合成过程中涉及10种酶，其中GPAT基因催化次黄嘌呤合成的第一步反应，且与AIRc基因紧密连锁，并且由一个启动子分向转录。鸡GPAT-AIRc启动子在AIRC方向的强度大约是GPAT方向的10倍[8]。

本文通过对猪GPAT基因外显子1和14进行多态位点扫描，检测到的三个突变位点中，两处为错义突变，一处为非错义突变，其中151 bp处的错义突变使苯丙氨酸变为亮氨酸，1 937 bp处的错义突变使亮氨酸变为精氨酸。研究通过PCR-SSCP技术进行遗传学分析，发现在GPAT基因第1外显子中，民猪、长白猪、北京黑猪、杜洛克均以A等位基因为主，其中民猪没有检测到B等位基因，大白猪以B等位基因为主，多态信息含量（PIC）的分析结果表明各猪种均为中度多态（0.25＜PIC＜0.5）。第14外显子中长白猪、大白猪、杜洛克和野杂猪均以A等位基因为主，其中民猪没有检测到B等位基因，北京黑猪两等位基因个体数相同，多态信息含量（PIC）的分析结果表明各猪种均为中度多态（0.25＜PIC＜0.5）不同基因型在民猪、北京黑猪、长白猪、大白猪、杜洛克和野杂猪间的分布存在着极显著差异（P＜0.05）。

本试验通过实时荧光定量PCR方法检测了GPAT基因在各组织中的表达差异，发现在肝脏中的表达量最高。从这一结果可以看出，肝脏在肌苷酸合成过程中具有重要的生理作用。由于缺乏相应个体肌苷酸含量的数据，本研究所得多态位点是否是不同猪种肉质风味差异的影响因素之一尚有待于进一步验证。

[1]Fuijmura S.Identification of tuste-active component components in the meat of the Japanese native chicken,Hinaidori and broilers and the effent of feeding treatments on taste-active components[J].Animal food science 1998,50(2):99-158.

[2]Zhou G C,Dixon J E,Zalk IN H.Cloning and expression of avian glutamine phosphoribosyl pyrophosphate amidotransferase.Conservation of a bacterial propeptide sequence supports a role for posttranslational processing[J].Journal of Biological Chemistry,1990,265(34):21152-21159.

[3]Wahana H,Oka J,Mizusawa N,et al.Molecular cloning of human amidophos phoribosyl transferase[J].Biochem Biophys Res Commun,1993,190(1):192-200.

[4]Wahana H,Yamaoka T,et al.Molecular cloning of rat Amidophoribosyltransferase[J].J Biol Chem.,1993,268(10):7225-7237.

[5]Gavalas A,Zalkin H.Analysis of the chicken GPAT/AIRC bidirectional promoter for denovo purine nucleotide synthesis[J].J Biol Chem,1995,270(5):2403-2410.

[6]Chow I S,Jacobson M.Inosine monphosphate,inosine and hypoxanthine in meat from broiler 5,7,and 9 weeks of age[J].Poultry Sci,1968,47:604.

[7]陈国宏,李慧芳,吴信生,等.泰和乌骨鸡肌肉肌苷酸含量变化规律及其遗传力估测[J].扬州大学学报:农业与生命科学版,2002,23(2):29-32.

[8]Gavalas A,Zalkin H.Coexpression of two closely linked avian genes for purine nucleotide synthesis from a bidirectional promoter[J].Mol Cell Biol,1993,13(12):7977.

[9]张海艳,于太永,关伟军.肌苷酸形成机理及其含量影响因素浅析[D].山西:山西农业大学,2004,6(3):17-21.

[10]束婧婷.鸡肌苷酸候选基因遗传效应及表达规律研究[D].扬州:扬州大学,2008:78-79.