刺五加叶中黄酮类提取物的抗氧化性及抑菌作用研究

张英华，关 雪

（东北农业大学食品学院，哈尔滨 150030）

我国刺五加资源丰富且其无毒副作用，是一种理想的天然抗氧化或防腐剂的提取源，并可以作为一种营养保健成分或天然的抗氧化剂添加于其他食品中。同时，植物提取物的直接开发利用，对于植物资源的综合开发利用也具有十分重要的意义。

刺五加为五加科植物刺五加（Acanthopanax senticosus Harms）的干燥根及根茎，其茎叶也可作药用，具有益气健脾、补肾安神功能。它是一种我国民间常用的传统中药，具有活血，抗恶性疟疾、抗病毒、抗肿瘤和止痛杀菌等药效[1]，用于脾肾阳虚，体虚乏力，食欲不振，腰膝酸痛，失眠多梦。现代医学研究表明，刺五加具有多种药理作用和临床应用[2-3]。

关于刺五加的化学成分，因其具有广泛的生理活性而受到国内外学者的关注,其成分含多种苷类，包括酚性苷和脂苷等；但目前对刺五加中黄酮类化合物的研究却很少。黄酮类化合物是一类重要的天然化合物，是植物产生的一类次生代谢产物，因其独特的化学结构而具有许多重要的生理、生化作用，对人体健康也起着重要的作用。早在20世纪30年代，就有学者发现黄酮类化合物具有维生素C样的活性。20世纪80年代以来，对黄酮类化合物的研究逐渐转向其清除自由基、抗衰老及对老年性疾病的防治功效上[4]。现代医学研究表明黄酮类物质具有降血糖、降血脂、抗心律失常等40多种生理活性。此外，黄酮类物质作为抗氧化剂还广泛应用于食品中。近年来许多试验表明，由于合成抗氧化剂对人体的危害，如丁基羟基茴香醚可一起动物肝脏增大等作用，现已限制或停止使用。因此，从药食两用植物中筛选出高效低毒且经济的天然抗氧化剂成为人们关注的焦点[5]。

本试验对刺五加中黄酮类化合物进行了定性和定量的测定，通过DPPH、清除羟自由基等方法测定了其抗氧化活性，并采用抑菌圈等实验对黄酮类物质的抑菌性进行研究。为进一步研究刺五加黄酮类化合物以及其开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

刺五加叶粗黄酮提取物，提取方法参照文献[6]。

菌种：大肠杆菌，金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及荧光假单胞菌。

1.2 试剂

芦丁标准品、DPPH（Sigma）、番红、EDTA、邻苯三酚、铁氰化钾、硫酸亚铁、BHT、VC、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均为分析纯、牛肉膏、蛋白胨等。

1.3 主要仪器

紫外分光光度计、无菌操作台、恒温培养箱、灭菌锅、旋转蒸发仪、真空泵、水浴锅、移液器、电子天平等。

1.4 方法

1.4.1 总黄酮含量的测定

1.4.1.1 标准曲线的绘制

准确吸取0.1 mol·L-1的芦丁标准溶液于10 mL容量瓶中，加30%乙醇至5.0 mL，加5%亚硝酸钠0.4 mL，摇匀，放置5 min，再加10%硝酸铝溶液0.4 mL，摇匀，放置5 min，加4%氢氧化钠溶液4.0 mL，摇匀，最后加30%乙醇定容至刻度，摇匀，放置10 min。在波长510 nm处测定其吸光度。以浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线[6]。

1.4.1.2 样品溶液的制备及含量测定

准确称取用石油醚脱脂的刺五加粉末2 g，用70%乙醇按1∶20料液比浸泡回流提取1 h，提取3次，合并滤液，浓缩后所得滤液置于100 mL容量瓶并定容至刻度，摇匀。按1.4.1.1方法测定吸光度。

1.4.2 刺五加叶总黄酮抗氧化性测定

1.4.2.1 还原能力测定[7]

取2.5 mL不同浓度的黄酮溶液，加入0.2 mol·L-1pH 6.6磷酸盐缓冲液2.5 mL及l%铁氰化钾2.5 mL，50℃水浴20 min，加入10%三氯乙酸溶液2.5 mL于3 000 r·min-1离心10 min，取上清液5 mL，加蒸馏水4 mL，及0.1%FeCl30.5 mL，混匀后于700 nm处测定吸光值。

1.4.2.2 清除超氧阴离子自由基实验[8]

在10 mL试管中加入4.5 mL pH 8.2磷酸缓冲液，25℃水浴20 min，分别加入1 mL不同浓度的试样溶液和25℃预热的0.4 mL 25 mol·L-1的邻苯三酚溶液并振荡3 min后立即加入100 μL 3%抗坏血酸，振荡均匀。在320 nm处测定吸光度。

式中，A0-不加样品时吸光度；A1-加入样品的吸光度；A2-不加邻苯三酚样品的吸光度。

1.4.2.3 清除羟基自由基实验方法[9]

在10 mL试管中加入磷酸缓冲液1.0 mL，番红0.2 mL，EDTANa2-Fe2+1.0 mL，再加入不同浓度的样品溶液7.0 mL，最后加入H2O2溶液0.8 mL，混匀后于40℃水浴30 min，在520 nm处测吸光度A值。试验结果以清除率E表示：

式中，A对照—以等体积的重蒸水代替样品溶液和H2O2溶液的吸光度。A空白—以等体积的重蒸水代替样品溶液的吸光度。

1.4.2.4 抑制DPPH自由基试验[10]

在10 mL试管中分别加入取各浓度测定液2 mL及2×10-4mol·L-1DPPH 2 mL，摇匀，30 min后在517nm测定其吸光度Ai，同时测定2 mL2×10-4mol·L-1DPPH溶液与2 mL无水乙醇混合液的吸光度Ac，以及2 mL测定液与2 mL无水乙醇混合液的吸光度Aj，根据下式计算测定液对DPPH的抑制率。

1.4.3 刺五加叶总黄酮提取物抑菌性测定

1.4.3.1 不同浓度黄酮提取物抑菌效果的比较[11]

配制浓度为1，2，4，6，8 g·L-1的刺五加黄酮提取物。用已灭菌的移液管分别移取以上五种浓度的刺五加黄酮溶液4 mL至已灭菌的液体培养基中，用4 mL无菌水做对照。在各培养基中接种1 mL供试菌悬液，摇床培养24 h，测定在OD600菌悬液的吸光度。

1.4.3.2 抑菌圈试验[12-15]

在上述五种不同浓度的刺五加黄酮溶液中分别放入直径为6 mm的灭菌滤纸片，浸泡12 h，干燥后，用紫外线照射灭菌10～15 min。用无菌镊子将浸透5种浓度的刺五加黄酮溶液的滤纸片放在含菌平板上，培养皿放到供试菌最适生长温度下培养48 h。用游标卡尺测定抑菌圈直径的大小，并以此判断不同浓度的刺五加黄酮溶液对供试菌的抑制效果。结果以mm表示，生理盐水做空白对照。为保证所测数据的精确性，每种菌作3个重复。

1.4.4 数据处理

采用SPSS统计软件进行数据统计分析，采用单因子方差分析进行差异显著性检验。与对照组比较，当P＜0.01表示具有极显著性差异，P＜0.05表示具有显著性差异，当P＞0.05时差异无显著性。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的测定和回归方程的建立

按1.4.1.1所示方法进行测定，由图1可得回归方程C=0.0091x-0.0073，相关系数为R2=0.9992

2.2 刺五加叶中总黄酮含量

按1.4.1.2所示的方法进行测定，做3次平行，得刺五加中总黄酮化合物的含量为0.34%。

2.3 刺五加叶总黄酮抗氧化能力的测定结果

2.3.1 还原能力测定

按1.4.2.1所示方法进行测定，以样品吸光值与浓度数据作图，如图2可知，刺五加黄酮样品具有较好的还原能力，是良好的电子供应者，其供应的电子可以使Fe3+还原成Fe2+，且随着刺五加黄酮浓度的增加其抗氧化能力也增加。

图1 芦丁溶液的标准曲线Fig.1 Standard curve of rutin

图2 不同浓度的刺五加黄酮溶液还原能力的比较Fig.2 Comparison of the reductive ability of different concentrations of acanthopanax flavonoids

2.3.2 清除O2-试验结果

按1.4.2.2所示方法进行测定，以清除率与浓度数据作图，如图3。以0.2 mg·mL-1BHT、VC和芦丁标准品做对照，见表1。

表1 0.2 mg·mL-1样品、VC、BHT及芦丁标品清除O2-.能力的比较Table 1 Comparison of clear O2-.ability of 0.2 mg·mL-1samples,VC,BHT and rutin

图3 不同浓度的刺五加黄酮溶液清除O2-﹒能力的比较Fig.3 Comparison of clear O2-﹒ability of different concentrations of acanthopanax flavonoids

由表1和图3可知，不同浓度的刺五加叶黄酮类化合物及VC、BHT及芦丁标准品都有较好的清除O2-能力，并随着刺五加黄酮类化合物含量的增加对O2-的清除率不断上升。当VC的浓度为0.2 mol·L-1时清除O2-能力达到78.9%，芦丁和BHT清除O2-能力相近，分别为36.5%和42.7%，而相同浓度的刺五加黄酮的抗氧化性就不及前两者，只有23.4%。但总的来说，刺五加黄酮有较好的清除O2-能力。

2.3.3 清除·OH试验结果

按1.4.2.3所示方法进行测定，以清除率与浓度数据作图，如图4。以0.2 mg·mL-1BHT、VC和芦丁标品做对照，结果见表2。

图4 不同浓度的刺五加黄酮溶液清除·OH能力的比较Fig.4 The comparison of clear·OH ability of different concentrations of acanthopanax flavonoids

表2 0.2 mg·mL-1的样品、VC、BHT及芦丁标品清除·OH能力的比较Table 2 Comparison of clear·OH ability of 0.2 mg·mL-1samples,VC,BHT and rutin

由表2和图4可知，不同浓度的刺五加黄酮类化合物对OH-有较强的清除能力，刺五加黄酮类化合物浓度在0.2 mg·mL-1时清除率为73.9%，并随着刺五加黄酮浓度的增加，OH-清除能力越来越强，浓度为0.2 mg·mL-1L的芦丁标品清除·OH的能力最强，达到91.3%。相同浓度0.2 mg·mL-1刺五加黄酮清除·OH的能力较VC要好得多。

2.3.4 清除DPPH自由基试验结果

按1.4.2.4所示方法进行测定，以清除率与浓度数据作图，结果见图5。

以0.2 mg·mL-1BHT、VC和芦丁标品做对照，结果见表3。

表3 0.2 mg·mL-1的样品、VC、BHT及芦丁标品清除DPPH能力的比较Table 3 Comparison of clear DPPH ability of 0.2 mg·mL-1samples,VC,BHT and rutin

图5 不同浓度的刺五加黄酮溶液清除DPPH能力的比较Fig.5 Comparison of clear DPPH ability of different concentrations of acanthopanax flavonoids

由表3和图5可知，在0.05～0.8 mg·mL-1的浓度范围内，样品对DPPH自由基的清除能力随着浓度的升高显著增强。而作为对照的VC、BHT及芦丁标品，在所选的浓度下，BHT的清除能力明显强于样品和VC，0.2 mg·mL-1的BHT的清除率达到68.2%，在同一浓度下，芦丁标品的清除DPPH的能力最强，达到81.9%，VC的清除能力最弱为16.9%。

2.4 刺五加叶总黄酮提取物抑菌作用试验结果

2.4.1 液体培养法测定刺五加叶中总黄酮对各菌种的抑菌效果

由图6可知，刺五加黄酮对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及荧光假单胞菌具有较强的抑制性，且随着刺五加叶总黄酮浓度的不断增加，其抑菌性能也逐渐增强。刺五加叶总黄酮提取物浓度为8 g·L-1时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及荧光假单胞菌的抑菌率分别为83.1%、82.2%、69.0%和57.1%，由此可初步确定刺五加叶总黄酮提取物对各种菌的抑制效果由强到弱的顺序为：大肠杆菌＞金黄色葡萄球菌＞沙门氏菌＞荧光假单胞菌，平板试验结果与吸光度变化实验结果相似。

图6 加入不同浓度刺五加黄酮各菌悬液抑菌率的比较Fig.6 Comparison of bacteriostatios ratio of different concentrations of acanthopanax flavonoids

2.4.2 抑菌圈试验结果

表4结果表明，刺五加叶黄酮提取物对供试菌有较显著的抑制作用，并且随着刺五加黄酮提取物浓度的增加，其抑菌效果明显增高，尤其对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制效果更佳，抑菌圈直径分别为19.3，18.7 mm，对荧光假单胞菌的抑制效果稍弱。并且在P＜0.05范围内各浓度黄酮提取物间对供试菌的抑制率差异显著。

表4 不同浓度刺五加叶黄酮提取物对供试菌的抑菌效果Table 4 Bacteriostatic effect of different concentration acanthopanax flavonoids to the test bacteria

3 讨论与结论

a.本试验采用乙醇回流法提取刺五加叶中的黄酮类化合物，采用分光光度法以芦丁为标样测定其中总黄酮提取物的含量为0.34%。由于试验中仅以芦丁为标样进行测定，其他吸收峰由于缺乏标样仍不能准确定性与定量。若能分离得到更多刺五加黄酮类化合物组成物质的标样，将有助于建立精度高的刺五加叶总黄酮含量的分析方法。

b.刺五加叶总黄酮提取物具有较明显的抗氧化作用，并随提取物添加量的增加而增强。通过抗氧化试验，得到以下结论：①从清除羟自由基的试验可以看出，刺五加黄酮提取物在低浓度时清除能力较弱，当添加浓度达0.2 mg·mL-1时清除率达到73.9%；②通过清除超氧阴离子的比较实验表明，0.2 mg·mL-1的黄酮提取物和BHT清除O2-的清除率分别为23.4%和42.7%，说明该黄酮提取物具有较强的清除超氧阴离子能力；③从清除DPPH实验可知，刺五加黄酮提取物的清除能力要比VC好，当浓度为0.8 mg·mL-1时，清除率为57.8%，芦丁标准品的清除DPPH的能力最强，达到81.9%。

c.刺五加叶总黄酮提取物对各菌种均有较好的抑制作用，并随着提取物浓度增大其抑制效果越明显。提取物浓度为8 g·L-1时，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌及荧光假单胞菌的抑菌率分别为83.1%、82.2%、69.0%和57.1%。

通过研究可知，刺五加黄酮类成分对细菌有较强的，较广谱的抑菌活性，不过其表现出的治疗活性成分并未研究清楚，因此在以后的研究中要继续对刺五加总黄酮的生物活性、药理作用进行深入的研究，为刺五加这一野生草药在功能食品、医药工业的发展提供理论依据。

总之，刺五加黄酮类化合物应用及其广泛，除了具有良好的抗氧化能力以外，还具有多种生物活性，如某些黄酮类化合物对心血管疾病有防治和治疗的作用及抗过敏作用等。黄酮类化合物的生物活性和低毒作用使其在临床上有巨大的潜力，但由于其含量低，分离难等自身的一些原因，给黄酮类化合物的研究带来一定的困难。因此，黄酮类化合物的许多功能还有待进一步开发和研究。

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