固氮菌的筛选及其对菜场垃圾堆肥化的影响

王晓辉，姜 虎，刁 婥，张立菲，张 颖*

（1.东北农业大学资源与环境学院，哈尔滨 150030；2.黑龙江省环境保护科学研究院，哈尔滨 150056）

随着城市化进程加快，环境问题，特别是城市生活垃圾处理问题已成为关注焦点。直接倾倒和简易填埋处理方式对土壤、地下水、大气等都会造成现实的影响和潜在危害。特别是填埋场的渗沥水，由于未进行必要的收集和处理，导致水源污染。垃圾填埋场污染地下水源，严重污染、破坏垃圾填埋场周边环境的情况时有发生。如何解决垃圾问题，已引起全社会的高度重视[1]。

堆肥是目前广泛应用且能有效处理城市生活垃圾的方法之一，其实质就是利用微生物在一定温度、湿度和pH条件下，使城市有机物质发生生物化学降解，形成一种类似腐殖质土壤的物质，用作肥料和改良土壤。堆肥化的产物称为堆肥。堆肥是一种深褐色、质地松散、有泥土味的物质。这种物质的主要成分是腐殖质，其养料价值不高，是一种极好的土壤改良剂和调节剂。城市生活垃圾在堆肥过程中往往会损耗大量的氮，使其含量大大降低。然而，氮是农作物生长的三大要素之一，对提高农作物的产量具有重要意义[2]。

石春芝等曾尝试在堆肥中加入固氮菌和纤维素分解菌，利用两者的互生作用（纤维素分解菌可将堆肥中的一些枯枝、落叶、树皮、朽木等有机组分分解成化学结构简单的物质，为固氮菌提供碳源）来提高堆肥的含氮量，从而提高堆肥的肥效[3]。但其只是初步尝试，所用菌种为广东省微生物研究所直接提供的褐球固氮菌，未对菌种进行筛选。陈世和等曾对城市生活垃圾堆肥过程中的主要微生物的分离、鉴定和酶活力进行研究[4]。本试验从土壤中筛选出优势固氮菌，在菜场垃圾中加入这些固氮菌，利用其生物作用来提高堆肥的含氮量，从而提高堆肥质量，缩短堆肥周期。

1 材料与方法

1.1 固氮菌的筛选

1.1.1 原理

自生固氮菌具有固氮能力，能在无氮培养基上生长繁殖。取pH 6.5以上的耕作土壤，经过适当处理后，加入到无氮培养基上，在适合的温度下培养3 d，在平板表面就会出现褐色、粘稠、半透明的菌落。加1%淀粉可促进褐球固氮菌的生长，而维涅兰德固氮菌则是该属中唯一能利用鼠李糖的固氮菌。如加入蔗糖并调pH 5～6的范围时可促进拜氏固氮菌的生长。最后挑取典型的菌落，在无氮培养基平板上经过数次划线便可得到纯种的单菌落。

1.1.2 材料

样品：上海师范大学校园泥土。

培养基：阿须贝（Ashby）无氮培养基。

1.2 堆肥化的处理方法[5]

1.2.1 扩大培养

分别将各培养基上的菌种接种于盛有300 mL对应碳源的Ashby培养液的三角瓶中，在28℃下振荡培养3 d，待培养液混浊。将得到的三种菌种及它们的混合菌种分别倒入装有菜叶的桶中。具体方法如下：塑料桶装菜叶10 kg，大小约为8 cm×5 cm，以5%的接种量接种。接种后将塑料桶置于室温下，早晚各搅动1次，并保持湿润。间隔3 d用下述方法对堆肥的全氮，铵态氮和硝态氮的含量进行测定。具体的处理方法见表1。

表1 具体处理方法Table1 Treatment methods of the compost

1.3 全氮，硝态氮，铵态氮的测定[6]

样品中全氮量的测定：半微开氏法（K2SO4-CuSO4-Se蒸馏法）；样品中铵态氮含量的测定：蒸馏滴定法（2NKCl浸提-蒸馏法）；样品中硝态氮含量的测定：酚二黄酸比色法

1.4 固氮菌降解菜场垃圾中微生物数量的变化处理过程中的数量分析[7]

稀释涂布法：分别用牛肉膏蛋白胨培养基、高氏I号培养基、查氏培养基和豆芽汁培养基培养分离计数细菌、放线菌、霉菌和酵母菌。

分别用以淀粉、鼠李糖、蔗糖和葡萄糖为唯一碳源的无氮培养基培养分离计数褐球固氮菌、维涅兰德固氮菌、拜氏固氮菌以及它们的混合固氮菌。

2 结果与分析

2.1 筛选出的菌株

结果见表2，由表2可见，2.1%淀粉可促进褐球固氮菌的生长，维涅兰德固氮菌则是该属中唯一能利用鼠李糖的固氮菌，加入蔗糖并调pH 5～6时可促进拜氏固氮菌的生长。我们在3组无氮培养基中加入不同碳源，即1%淀粉，鼠李糖，蔗糖并将pH值调至5～6，所以我们分别得到3种菌种即褐球固氮菌，拜氏固氮菌及维涅德兰固氮菌。褐球固氮菌和拜氏固氮菌菌落数相似，维涅德兰固氮菌的菌落数明显少于褐球固氮菌和拜氏固氮菌。

2.2 五组堆肥装置中含氮量的变化

2.2.1 全氮含量的变化

全氮的含量随时间变化见图1。由图1中可知接种混合固氮菌的堆肥装置中的全氮含量最高，接下来依次为褐球固氮菌，拜氏固氮菌，维涅兰德固氮菌，最后是空白，且各组的全氮含量呈上升趋势从第7天开始趋于稳定。

表2 筛选得到的菌株Table2 Results of selected strains

图1 全氮含量的变化Fig.1 Changes of total nitrogen

2.2.2 铵态氮含量的变化

在反应进行中，铵态氮的含量随时间的变化见图2。从图2中可知接种混合菌种的堆肥装置中的铵态氮含量最高，接下来依次为褐球固氮菌，拜氏固氮菌，维涅德兰固氮菌，含量最低的为空白。且各组中的铵态氮含量均呈上升趋势但从第7天开始下降而到第13天后趋于稳定。

2.2.3 硝态氮含量的变化

硝态氮的含量随时间的变化见图3。

由图3可知，接种混合固氮菌的堆肥装置中的硝态氮含量最高，接下来依次为褐球固氮菌，拜氏固氮菌，维涅兰德固氮菌。含量最低的为空白。各组中硝态氮含量都呈上升趋势，到第13天开始趋于稳定。

图2 铵态氮含量的变化Fig.2 Changes of ammonium nitrogen

图3 硝态氮含量的变化Fig.3 Changes of nitrate nitrogen

2.2.4 堆肥过程中菜叶的变化情况

接种混合菌种的菜叶5 d后周边开始糜烂，12 d后菜叶已基本糜烂，接种褐球固氮菌、拜氏固氮菌、维涅兰德固氮菌的菜叶分别在7、9、10 d后菜叶周边开始糜烂，14、17、19 d后菜叶基本糜烂。而未接种固氮菌的菜叶（空白）一直到实验结束即21 d后都未见糜烂。说明混合菌种的堆肥周期最短，接下来依次为褐球固氮菌、拜氏固氮菌、维涅兰德固氮菌。

3 讨论与结论

在固氮菌的作用下，接种混合固氮菌的堆肥中铵态氮、硝态氮含量增加最多，接下来依次为褐球固氮菌、拜氏固氮菌、维涅兰德固氮菌。由于第五组堆肥中加了混合固氮菌后，三种固氮菌共同作用于菜叶，所以其堆肥中氮含量要比其他组的多。

在低温堆肥初期，五组堆肥中氮含量的变化趋势相似。空白组中未加固氮菌，但其全氮，铵态氮、硝态氮含量增加。

在堆肥中期，铵态氮含量的、降低，而硝态氮的含量增加可能是由于一部分铵态氮转化为氨类物质从堆肥中逸出；一部分铵态氮转化为硝态氮，进而转化为有机氮。接种固氮菌的堆肥中，固氮菌大量生长繁殖，使堆肥中的硝态氮、铵态氮含量比空白组多。接种褐球固氮菌的堆肥中的全氮，铵态氮，硝态氮的含量要比接种拜氏固氮菌，维涅兰德固氮菌高。

堆肥中全氮、铵态氮、硝态氮含量变化及堆肥周期说明混合菌种的堆肥效果比单一菌种堆肥效果好，其中褐球固氮菌的堆肥效果比拜氏固氮菌及维涅兰德固氮菌好。

在堆肥物料中加入自生固氮菌提高堆肥中的含氮量和堆肥肥效。而固氮菌本身具有的生物活性增加肥料的生物学性能，将其施用于土壤，增加土地肥力和土壤中的功能微生物数量，有利于土壤中物质分解与转化，改良土壤，保护环境。

[1]臧又超.我国城市生活垃圾现状与管理问题[J].环境保护,1998(8):41-43.

[2]Tang Y J.Research of the refuse and its treatment in Shanghai City[J].Chongqing Environ Sci，1997,19(2):30-32.

[3]石春芝,蒲一涛,郑宗坤,等.垃圾堆肥固氮菌对堆肥含氮量的影响[J].应用与环境生物学报,2002,8(4):419-421.

[4]陈世和,张所明,宛玲,等.城市生活垃圾堆肥处理的微生物特性研究[J].上海环境科学,1989,8(8):17-21.

[5]Chen H B,Tao H,Feng Q L,et al.Study for the status quo of municipal refuse disposal in China[J].J Wuhan Urban Construct Instit,1997,14(3):40-44.

[6]Pu Y T,Zhong Y H,Zhou W L.The mixed culturing of nitrogen-fisation bacteria and cellulose decomposing organism and the effects on the decomposing of the household garbage[J].Eniviron Sci Technol,1999,84(1):15-18.

[7]沈萍,范秀容,李广武.微生物学实验[M].北京:高等教育出版社,1999(6):214-215.