新一代重组人粒细胞集落刺激因子的工业化发酵、复性和纯化

宋 爽 蒋文宏 蒋永平，，*(中国医学科学院 北京协和医学院 苏州方舟生物医药研发中心，苏州 56)

2(苏州方舟基因药业有限公司，苏州 215126)

新一代重组人粒细胞集落刺激因子的工业化发酵、复性和纯化

宋 爽1蒋文宏2蒋永平1，2，*1(中国医学科学院 北京协和医学院 苏州方舟生物医药研发中心，苏州 215126)

2(苏州方舟基因药业有限公司，苏州 215126)

工业化大规模发酵、复性和纯化突变型人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSFa)，并测定其体外生物学活性。利用定点突变和DNA重组技术获得突变型G-CSF(rhG-CSFa)。通过40 L发酵罐发酵基因工程菌株获得rhG-CSFa包涵体，经过一系列透析后，通过离子交换柱和分子排阻层析进行纯化，并使用高效液相色谱技术对纯化后的rhGCSFa进行纯度分析。利用G-CSF依赖细胞株(M-NFS-60)测定纯化后的rhG-CSFa体外活性效价。结果表明，rhGCSFa表达量占全菌蛋白的31.2%，通过优化复性条件，rhG-CSFa复性率达到11.36%，纯化后rhG-CSFa的纯度达到99.11%。体外活性实验显示，与野生型G-CSF相比，rhG-CSFa在相同浓度下能诱导 NFS－60细胞株获得更高的细胞增殖率。rhG-CSFa工程菌株能够高表达rhG-CSFa，可用于工业化大规模生产，生产的rhG-CSFa具有较高的生物活性、稳定性和纯度。rhG-CSFa大规模生产的成功为该药物未来的临床运用打下了良好的基础。

重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF);发酵;复性;纯化;生物活性

引言

人粒细胞集落刺激因子(human granulocyte colony stimulating factor，hG-CSF)是由人体内皮细胞、单核细胞、巨噬细胞及成纤维细胞分泌的一种糖蛋白。它由174个氨基酸组成，能够促进骨髓内粒细胞前体的增殖、分化［1］。近年来研究表明，GCSF对于造血干细胞有着比较强的动员能力，因此在骨髓移植中有着广泛的应用［2］，但其对于造血祖细胞未见有直接的影响［3］。

野生型G-CSF复性率低、货架期短，往往需要反复给药，增加了患者的痛苦和治疗成本。本实验室采用累加和定点突变技术，成功表达出突变型人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSFa)。与野生型G-CSF相比，其N端增加了四个正电氨基酸残基，并将Cys17突变为Ala17。因而提高了rhG-CSFa的复性率、增强了与受体的亲和力，延长了血浆半寿期，提高了生物利用度和生物活性［4－5］。在 CTX处理的猕猴模型中，皮下注射新一代重组G-CSF(G-CSFa)和野生型G-CSF，可以显著降低嗜中性粒细胞减少症的程度和持续时间，用药期间患猴中性粒细胞绝对计数(ANC)曲线呈双峰模型。用药7天时即出现第一个峰值，患猴ANC提高37%，显著高于同等剂量的野生型G-CSF组，证明rhG-CSFa可以更快地提升白细胞计数，提示在临床使用时可以大大降低嗜中性粒细胞减少的化疗患者继发感染的可能性。同时还发现，停药后 rhG-CSFa组 ANC显著高于CTX处理前水平，而野生型G-CSF组ANC很快下降至CTX处理后水平［6］。药代动力学研究证明，rhG-CSFa具有更高的血浆稳定性和生物利用度［4］。急性和亚急性毒理研究发现，当rhG-CSFa用量达到临床注射剂量的680倍时，没有对小鼠造成明显的毒副作用和死亡，而且仍能有效刺激中性粒细胞的生成［7］。长期毒理研究表明 rhG-CSFa对于大鼠没有显著的毒性和免疫原性作用［8］。正因为 rhGCSFa的稳定性和安全性，所以其可以作为嗜中性粒细胞减少症新一代的临床治疗药物。本实验主要研究rhG-CSFa的工业化大规模发酵生产、复性和纯化，为rhG-CSFa的临床应用打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料

AKTAexplorer自动化纯化系统(GE Healthcare，Buckinghamshire，United Kingdom)、40L发酵 罐 (New Brunswick Scientific，N.J.，USA)、CEPA-Z41工业化自动连续离心机(Carl Padberg Zentrifugenbau GmbH，Lahr/Schwartzwald，Germany)、Waters 2695高效液相色谱仪(Waters，Milford，USA)、盐 酸 胍 (guanidine-HCl，GdnHCl)、EDTA(Amresco公司)、GSSG(glutathione disulfide，Sigma-Aldrich公司)、GSH(glutathione，Sigma-Aldrich 公司)、尿素(urea，上海实验试剂有限公司)、β-ME(β-巯基乙醇，上海凌峰化学试剂有限公司)、MTT(Sigma-Aldrich公司)、Triton X-100(Sigma-Aldrich公司)、D-mannitol(Sigma-Aldrich 公司)E.coli M15菌株(kan抗性，QIAGEN公司)、pQE3(表达载体，QIAGEN 公司)、M-NFS-60(ATCC)。

1.2 方法

1.2.1 工程菌的获得

用带有rhG-CSFa基因的 pQE3表达载体转化E.coli M15菌株。筛选能够稳定地高表达rhG-CSFa的重组菌株作为工程菌，冻存于液氮中。

1.2.2 rhG-CSFa的发酵和包涵体洗涤

将在液氮甘油管中冻存的基因工程菌种接种于装有20 mL LB培养基(含有Amp 50mg/L和Kan 25mg/L)的小试管中，37℃，200 r/min的条件下过夜培养，次日接种于装有500 mL LB培养基的摇瓶中，培养至菌体OD600值达到所需要求后，将其作为一级种子液。

将40 L发酵罐(New Brunswick Scientific，USA)空罐灭菌后加入30 L培养基(蛋白胨20 g/L、酵母膏20 g/L、氯化钠5 g/L)进行实罐灭菌。冷却后将一级种子液接种于发酵罐中，调节通气量和转速，维持溶氧(DO)在35% ～80%，37℃培养。当菌体OD600达到5.3时，加入7 mM的 IPTG诱导 rhGCSFa的表达。诱导1 h后，加入2 L已灭菌的5×培养基(蛋白胨100 g/L、酵母膏100 g/L、氯化钠25 g/L)以补充营养。发酵过程中自动添加浓盐酸(HCl)和氨水(NH3·H2O)，将发酵液pH维持在7.2左右。随时调节通气量和转速，保证溶氧(DO)维持在30%以上。

发酵罐接种前取样一次，并将此样品作为后续比色测定菌密度(OD600)的参比溶液。接种后每隔1 h取样一次，测菌体光密度(OD600)，诱导4 h后终止发酵，测定此时发酵液 OD600值。发酵液利用CEPA-Z41工业化自动连续离心机离心收集菌体，记录菌体湿重。

收集的菌体用裂解缓冲液(Tris 50 mmol/L，EDTA 2 mmol/L、NaCl 100 mmol/L、Triton X-100 0.5%v/v、溶菌酶 1 mg/mL、pH8.0)重悬，4 ℃搅拌至黏稠，超声波破碎菌体至不黏，离心(7 000 r/min，25 min)获得包涵体，依次经过尿素缓冲液(Tris 50 mmol/L、EDTA 2 mmol/L、Urea 2 mol/L、pH8.0)和纯水洗涤后得到较纯的包涵体，－80℃保存，SDSPAGE检测包涵体。

1.2.3 rhG-CSFa的复性和纯化

将0.7 g rhG-CSFa包涵体溶于70 mL溶解液(Tris 50 mmol/L、GdnHCl 6 mol/L、EDTA 5 mmol/L、β-ME 1%v/v、pH 7.5)，避光搅拌 2 h，离心(13 000 r/min、7 min)，上清用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，称重离心管底沉淀质量。上清随后于400 mL稀释液(Tris 25 mmol/L、Urea 2.5 mol/L、EDTA 2.5 mmol/L、Tween-80 0.004%v/v、GSH 4 mmol/L、GSSG 0.4 mmol/L、pH 7.5)中缓慢稀释，稀释后的 rhGCSFa溶液于4℃下搅拌放置60 h。

从3 M尿素Tris-pH8.0缓冲液开始，逐步降低pH、尿素和盐浓度对 rhG-CSFa进行透析复性。透析袋内外体积比为1:10以上，依次用4L的 A液(Tris 50 mmol/L、pH7.5)和 B 液(NaAc 25 mmol/L、Tween-80 0.004%v/v、pH5.4)各透析 2 次，每次 24 h(4℃下搅拌)。复性结束后，蛋白液离心(10 000 r/min，10 min)，上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度，根据复性前后蛋白浓度和蛋白液体积估算复性率。

复性后的 rhG-CSFa通过 CM-Sepharose阳离子交换柱纯化，所用平衡缓冲液为20 mmol/L NaAc-HAc(pH5.4)，上样后用0～1 mol/L的 NaCl进行梯度洗脱。洗脱液超滤浓缩后使用1.5 L Superdex 75凝胶柱(prep grade)层析纯化。以上纯化工作均在AKTA Explorer自动化纯化系统中完成。

1.2.4 MTT法检测复性后rhG-CSFa的生物学活性

取对数期生长的 M-NFS-60细胞，分别加入不同浓度的蛋白溶液，以野生型G-CSF作为对照，设置 1、2、5、10、20、40、80、160、330、670 pg/mL 十个浓度梯度，每个浓度3组平行。培养40～48 h后，每孔加入20 μL MTT溶液，继续培养5 h后，加入裂解液，混匀后记录570 nm处吸光度值。

1.2.5 Western Blot鉴定 rhG-CSFa

rhG-CSFa单克隆抗体分泌细胞株由本实验室前期研究筛选、保存［5］。单克隆抗体细胞株经24孔板扩大至50 mL培养瓶，此时取10 mL细胞上清进行western blot鉴定。

rhG-CSFa包涵体、白细胞分化抗原透明质酸结合域(CD44－HABD)以及纯化后的 rhG-CSFa经15%胶浓度的 SDS-PAGE分离后，转印(恒流300 mA、70 min、湿转)至 PVDF膜上，膜在 2%BSA 的BST液中4℃封闭过夜，PBT液洗膜3次，每次10 min;与单克隆抗体细胞株培养上清 (一抗)于37℃下孵育 1 h，PBT液洗膜 3次，每次 10 min，37℃下在碱性磷酸酶(AKP)标记的羊抗鼠 IgG(二抗，用 PBS稀释至1∶2000)中孵育1 h，PBT液洗膜3次，每次10 min，于显色液(NBT/BCIP)中显色，待条带显色后蒸馏水漂洗终止显色。

1.2.6 rhG-CSFa蛋白纯度分析

rhG-CSFa蛋白样品经过0.45 um的膜过滤后，精密量取 10 μL注入高效液相色谱仪(waters 2695)，通过 Delta-PAK C18柱进行梯度洗脱，流动相为A液0.1%三氟乙酸-水溶液，B液0.1%三氟乙酸－乙腈溶液。以流速为1 mL/min，梯度洗脱20 min(洗脱程序为，A液从10% ～30%，B液从90%～70%)，检测波长220 nm，记录色谱图(本实验委托苏州大学卫生与环境技术研究所检测中心完成)。

2 结果

2.1 rhG-CSFa发酵以及包涵体洗涤

40 L发酵罐加入30 L培养基，当OD600达到5.3时取样一次，同时加入7 mmol/L IPTG诱导菌体表达重组蛋白，继续培养4 h。发酵结束后离心收集菌体，湿重约628 g。按上述方法洗涤包涵体后，包涵体湿重196 g。计算得到 rhG-CSFa包涵体产率约为31.2%。

发酵前后菌体SDS-PAGE分析结果如图1所示(M为标准蛋白 marker、1为 IPTG诱导前全菌、2为IPTG诱导后全菌、3为 rhG-CSFa包涵体、4为 rhGCSFa凝胶过滤后样品、5为 CD44-HABD蛋白)，诱导前菌体(lane 2)未发现rhG-CSFa条带，而诱导后菌体(lane 3)除正常菌体蛋白外，明显可见 rhGCSFa条带。结果显示，所获得的基因工程菌株能够高表达重组 G-CSFa蛋白(rhG-CSFa)，适合作为rhG-CSFa工业化大规模生产的工程菌。

2.2 rhG-CSFa复性结果

逐步降低尿素的浓度对rhG-CSFa进行透析复性。复性结束后蛋白浓度为0.159 mg/mL，蛋白液pH=5.31，并且杂蛋白较少。根据如下公式计算，复性率为11.36%。

图1 rhG-CSFa诱导表达和纯化后样品的SDSPAGE分析Fig.1 SDS-PAGE analysis ofrhG-CSFa induction and purification

2.3 rhG-CSFa纯化

纯化后，rhG-CSFa纯度达到98%以上，超滤浓缩后，rhG-CSFa的浓度达到0.3 mg/mL，蛋白液中加入5%的D-甘露醇(D-mannitol)，过滤除菌，分装至安碚瓶中，长期储存于4℃冷库。

2.4 MTT法检测复性后rhG-CSFa的生物学活性效价

野生型G-CSF(参考品)活性效价已知，为3.93×107IU/mL(1IU=0.8×10－11g)。根据公式计算，rhG-CSFa样品(待检样品)活性效价为(1.23±0.473)×108IU/mL，高于野生型 G-CSF。结果如图2。

活性效价计算公式:

2.5 Western blot鉴定

如图3所示(M为标准蛋白 marker、1为 IPTG诱导前全菌、2为 IPTG诱导后全菌、3为 rhG-CSFa包涵体、4为rhG-CSFa凝胶过滤后样品、5为阴性对照(CD44－HABD蛋白)，对纯化后的 rhG-CSFa进行Western blot分析。结果表明，纯化后的 rhGCSFa可以与特异的单克隆抗体结合。针对 rhGCSFa的单克隆抗体可以特异性地标记rhG-CSFa包涵体和纯化后的 rhG-CSFa，而与 CD44－HABD(阴性对照)无反应。表明经过发酵、复性和纯化后的rhG-CSFa具有抗原活性。

2.6 rhG-CSFa蛋白纯度分析

图2 野生型G-CSF以及rhG-CSFa体外活性比较Fig.2 A comparison of in vitro activity between wild-type G-CSF and rhG-CSFa

图3 rhG-CSFa诱导表达和纯化后样品的western blot分析Fig.3 Western blot analysis of rhG-CSFa induction and purification

图4 为高效液相色谱分析结果，测定rhG-CSFa在1.6min时为单一色谱峰，计算其纯度为99.11%。

图4 rhG-CSFa蛋白液在波长220 nm处的高效液相色谱图谱(纯度为99.11%)Fig.4 Analysis of the purity of rhG-CSFa by HPLC at UV wavelength 220 nm (theprotein purity is 99.11%)

3 讨论

根据本实验室前期实验积累的数据(未发表)，发现在连续培养时，IPTG诱导1 h后加入浓缩培养基，同时全程控制溶氧(DO)在30%以上、pH稳定在7.2左右，能够获得最多的菌体和重组蛋白。pH过高和过低都不利于菌体的生长和重组蛋白的合成。发酵过程中用于控制pH值的酸和碱通常有HCl、NaOH和氨水，但要注意 NH+4不超过170 mmol/L［9］。基因工程菌的生长对发酵液中的溶解氧水平也有着较高的要求。当溶氧(DO)在40%时，可满足菌体生长和高效表达重组蛋白的需要。当细菌在进入对数生长期后，为了满足生长需要耗氧速度较快，此时若不增加溶解氧的供应量，细菌将通过无氧酵解的途径进行糖代谢，产生大量乳酸等有害代谢产物，抑制工程菌的生长，并产生大量杂蛋白，在影响目的蛋白表达量的同时增加纯化的难度［10－11］。但溶氧不可过多，否则会产生氧中毒现象，影响菌体生长和蛋白表达［12］。所以在发酵过程中，严格控制发酵液pH和溶氧水平对于发酵的成功至关重要。另外，诱导后添加新鲜培养基(即连续培养)可以显著提高重组蛋白的表达。诱导前菌体大量扩增，消耗了大量营养物质，因此，诱导后添加高浓度营养物质可以增加各种养分的含量，最终提高重组蛋白的产量。

野生型G-CSF分子中存在5个半胱氨酸，构成两对二硫键。第17位的半胱氨酸残基不参与二硫键的形成，然而在复性时它会参与形成分子间和分子内二硫键，从而干扰正常二硫键的形成，进而大大降低野生型G-CSF的复性率。与野生型G-CSF不同的是，新一代rhG-CSFa的17位半胱氨酸氨酸残基(Cys)突变为丙氨酸(Ala)，因此降低了二硫键错误的概率，最终提高了G-CSF的复性率。本实验通过包涵体复性前后蛋白液的浓度来估算rhGCSFa的复性率。蛋白复性过程中主要有两个步骤会产生沉淀，一是包涵体溶解后残留一些不可溶的沉淀，二是在透析过程中会析出大量蛋白。之所以不采用复性过程中产生沉淀的质量估算复性率，主要因为沉淀在离心后含水量较高而无法准确称量，容易产生很大误差，因此用透析前后溶液的蛋白浓度可以更真实地反应复性率。

复性后用 CM-Sepharose阳离子交换柱能够较好地纯化rhG-CSFa，首先，离子交换柱能够起到浓缩样品的作用;其次，离子交换柱可以去除样品中的内毒素，使得rhG-CSFa的后续临床研究以及未来的临床运用成为可能。并且SDS-PAGE检测结果也显示，经CM-Sepharose阳离子交换柱纯化的样品，杂质较少，浓度较高。

虽然经CM-Sepharose阳离子交换柱纯化的样品纯度已经较高，但是仍会残留微量杂蛋白，这是因为它们与rhG-CSFa带电荷相似，难以用离子交换柱分离纯化。因此还需使用分子排阻层析技术(分子筛)对阳离子交换柱纯化后的样品进行进一步的精制，从而使带电相同但相对分子质量不同的蛋白分子得以分离纯化。本课题使用Superdex 75凝胶柱(prep grade)，可以高效、快速地进行rhG-CSFa蛋白纯化，能够满足工业化大规模生产的需求，从而为rhG-CSFa作为药品的应用提供了技术上的可行性。从图4中可以看出，蛋白样品纯度较高(99.11%)，可以用于后续的细胞活性实验和其他实验。

应用依赖hG-CSF的细胞株M-NFS－60作为检测细胞株，通过 MTT法进行 rhG-CSFa体外细胞活性实验。结果显示，表达产物rhG-CSFa的体外活性效价为(1.23±0.473)×108IU/mL，高于野生型 GCSF，其ED50是野生型 G-CSF的2倍。结果与本实验室前期实验基本相符［6］，使用rhG-CSFa第7天时患猴ANC已显著高于同等剂量的野生型G-CSF组，表明rhG-CSFa可以更快地提升白细胞计数，出现该结果的原因可能与rhG-CSFa的ED50高于野生型GCSF有关，所以能够更快地发挥生物学功能。

本课题成功地进行了新一代G-CSF的大规模发酵、复性和纯化，并得到了比野生型 G-CSF生物活性高的G-CSFa，为该蛋白作为一种更有效的促进中性粒细胞药品的临床运用打下了良好的基础。

［1］ Aglietta M，Montemurro F，Fagioli F，et al.Short term treatment with Escheria coli recombinant human granulocyte-macrophagecolony stimulating factor prior to chemotherapy for Hodgkin disease［J］.Cancer，2000，88:454 －460.

［2］ Bischof RJ，Zafiropoulos D，Hamilton JA，et al.Exacerbation of acute inflammatory arthritis by the colony-stimulating factors CSF-1 and granulocyte macrophage (GM)-CSF: evidence of macrophage infiltration and local proliferation［J］.Clin Exp Immunol，2000，119:361 －367.

［3］ Thomas J，Liu Fulu，Link DC.Mechanisms of mobilization of hematopoietic progenitorswith granulocyte colony-stimulating factor［J］.Curr Opin Hematol，2002，9(3):183 －189.

［4］ Liu Xiaoxiao，Jiang Yongping.Pharmacokinetic study of a novelrecombinant human granulocyte colony-stimulating factor in rats［J］.Chin Med Sci J，2010，25(1):45 －50.

［5］ Jiang Yongping，Jiang Wenhong，Dai Wei，et al.Effect of a mutant human granulocyte colony-stimulating factor，GCSFC17A-M，on leukopenia in mice and monkeys［J］.Proc Amer Assoc Cancer Res，2005，46:1185－1186.

［6］ Jiang Yongping，Jiang Wenhong，Qiu Yuchang，et al.Effect of a structurally modified human granulocyte colony stimulating factor，G-CSFa，on leukopenia［J］.J Hematol Oncol，2011，4(28):28－36.

［7］ 范洁，丁欣欣，蒋永平.新一代重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSFa)的临床前急性毒性和亚急性毒性研究［J］.复旦学报(医学版)，2012，39(1):25－30.

［8］ Xia Fei，Zhang Qingyu，Jiang Yongping.Chronic toxicity of a novel recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in rat［J］.Chin Med Sci J，2011，26(1):20 －27.

［9］ Lau J，Tran C，Licari P，et al.Development of a high celldensity fed-batch bioprocess for the heterologous production of 6－ deoxyerythronolide B in Escherichia coli［J］.J Biotechnol，2004，110:95－103.

［10］ 王海波，欧俊杰，耿信笃.重组大肠杆菌生产rhG-CSF发酵工艺的研究［J］.宁夏大学学报(自然科学版)，2004，25(2):161－163.

［11］ 李武平，王志武，朱丽娜，等.分泌型重组人生长激素工程菌的高密度发酵［J］.中国生物制品学杂志，2000，13(3):163－165.

［12］ Castan A，Nasman A，Enfors SO.Oxygen enriched air supply in Escherchia coli process:production of biomass and recombinant human growth hormone［J］.Enzyme Microb Tech，2002，30:847－854.

Large-Scale Production，Refolding and Purification of a Novel Recombinant Human Granulocyte Colony Stimulating Factor

SONG Shuang1JIANG Wen-Hong2JIANG Yong-Ping1，2，*1
1(Biopharmaceutical R＆D Center，Chinese Academy of Medical Sciences＆ Peking Union Medical College，Suzhou 215126，China)
2(Fanzhou Biopharmagen Corporation，Suzhou 215126，China)

The aim of this work is to produce，refold，and purify rhG-CSFa in large scale and determine its bioactivity.Using site-direct and additional mutagenesis，a structurally modified derivative of human G-CSF termed G-CSFa was constructed and fermented in a 40 liter bio-reactor.The rhG-CSFa inclusion bodies were extracted and refolded by a serial dialysis.The refolded G-CSFa was then purified by an ion-exchange column and size-exclusive chromatography，and the purity of rhG-CSFa was then analyzed by HPLC.Purified rhG-CSFa was tested for its biological activity in vitro using a G-CSF-dependent cell(M-NFS－60)assays.The 31.2%expressed G-CSFa protein yield was achieved and 11.36% refolding yield was obtained after optimizing the protein refolding conditions. The purity of rhG-CSFa was 99.11% after purification. In vitro studies demonstrated that rhG-CSFa induced a much higher proliferation rate of M-NFS－60 cell lines than wild-type GCSF at the same concentrations.The large-scale of recombinant G-CSFa in M15 strain was expressed with high yield，purity，and its biological activity and stability was confirmed.The success of large-scale production of GCSFa facilitates the clinical application of this potential drug.

rhG-CSF;fermentation;refold;purification;bioactivity

R318

A

0258-8021(2012)04-0552-06

10.3969/j.issn.0258-8021.2012.04.000

2012-02-26，录用日期:2012-04-18

国家“重大新药创制”科技重大专项(2009ZX09102-250)

*通信作者。E-mail:yjiang@biopharmagen.com