亚侧耳RAPD反应体系的优化

张跃新，闫宝松，马凤，胡伟

（黑龙江省林副特产研究所，黑龙江省非木质林产品研发重点实验室，黑龙江 牡丹江157011）

亚侧耳（Hohenbuehelia serotina）［1－2］商品名元蘑，又名冻蘑，是黑龙江省特有的山珍之一。亚侧耳肉质细腻，柔嫩鲜美，营养价值极高，含有人体所需的多种氨基酸、维生素和微量元素，经常食用具有加强肌体免疫，增强机体抵抗能力，益智开心，益气不饥，延年轻身等作用。

RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA）技术，是Williams和Welsh等1990年发明的一种新型DNA分子标记技术，该技术具有简单、快速、准确、灵敏度高和多态性丰富等优点，广泛应用于遗传图谱构建、基因定位和遗传多样性的检测［3］。本文在参考一般食用菌RAPD试验的基础上［4－5］，建立了亚侧耳 RAPD基本反应体系，并对基本反应体系进行了优化，为亚侧耳种质资源遗传多样性的RAPD分析奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

亚侧耳3号，为黑龙江省林副特产研究所培育菌株。

1.1.2 试剂

随机引物购自上海生工，基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技有限公司，Taq酶及相配套的反应缓冲液购自TaKaRa公司。

1.2 亚侧耳基因组DNA提取

采用天根生化科技有限公司的“快捷型植物基因组提取试剂盒”进行DNA提取。

1.3 亚侧耳RAPD反应体系设计

1.3.1 基本反应体系及基本反应条件

表1 基本反应体系（25μl体系）

基本反应程序

1.3.2 各反应因素梯度设计

表2 各反应因素梯度设计

2 结果与分析

2.1 亚侧耳模版DNA提取结果

将提取的亚侧耳DNA进行琼脂糖凝胶电泳（图1）。DNA呈现出一条明亮的谱带且无明显的拖尾现象，说明所提取的DNA比较完整，质量较高，可用于RAPD分析。

2.2 引物浓度优化结果

经引物筛选试验，在100个随机引物中筛选出S167、S467、S475、S460四个引物，其中引物以S167扩增效果最好，因此选用S167进行RAPD反应体系构建。在引物浓度优化试验中（图2）可知，5个引物浓度梯度中，除1号外，其它梯度扩增效果多态性均非常丰富，且条带清晰。因此，出于成本考虑，选择2号为最佳引物浓度，即25μL反应体系中添加1.5μL引物。

图1 亚侧耳DNA电泳结果

图2 引物浓度优化试验

2.3 模版DNA浓度优化结果

模版DNA浓度优化结果如图3，其中1号、2号扩增条带不清晰，扩增效果不好；3号、4号、5号扩增条带清晰，且呈多态性，出于成本考虑，选择3号浓度，即25μL反应体系中添加2.0μL模版DNA。

图3 模版DNA浓度优化试验

2.4 Taq酶浓度优化结果

Taq酶浓度优化结果如图4，各浓度条带均比较清晰，且多态性丰富，其中以2号、3号浓度条件下最为清晰，出于成本考虑，选择2号浓度，即25μL反应体系中添加0.2μL Taq酶。

图4 Taq酶浓度优化试验

2.5 10×PCR Buffer浓度优化结果

10×PCR Buffer浓度优化结果如图5，以2号浓度最为清晰，因此25μL反应体系中添加2.0μL10×PCR Buffer溶液。

图5 10×PCR Buffer浓度优化试验

2.6 dNTP浓度优化结果

图6 dNTP浓度优化试验

dNTP浓度优化如图6，其中1号、2号、3号浓度条件下扩增效果均比较清晰，且条带呈多态性，其中1号浓度条件下扩增效果最为清晰，因此25μL反应体系中添加3.0μL dNTP溶液。

3 结论

在RAPD反应中，影响PCR反应的因素很多，其中包括PCR缓冲液、dNTP的浓度、循环参数（退火温度、变温时间、PCR仪），Taq DNA聚合酶的来源及型号、模板DNA的质量和含量、引物纯度及浓度、DNA污染的共抽提和扩增干扰等。本文对RAPD反应体系中的10×PCR Buffer浓度 、dNTP浓度、模板DNA浓度、引物浓度、Taq酶浓度这5个主要影响因素进行了优化，最终确立了亚侧耳RAPD－PCR反应体系和反应程序。反应体系（25μL）：10×PCR Buffer 2.0μL、2.5mM／L dNTPs3.0μL、5U／μL Taq酶0.20μL、5μM／L引物1.5μL、200ng／μL模板 DNA 2.0μL、去离子水16.30μL。PCR 反应程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，37℃退火30s，72℃延伸2min，40个循环，72℃延伸10min，4℃forever。

［1］ 戴芳澜.中国真菌总汇［M］.科学出版社，1979.

［2］ Liu Y，Bau Tolgor.A new species of Hohenbuehelia from China［J］.Mycotaxon.2009.

［3］ 刘明，王继华.DNA分子标记技术.东北林业大学学报，2003，31，（6）：65－67.

［4］ 李三署，林新坚.姬松茸和双胞蘑菇不同菌株的RAPD扩增研究［J］.食用菌学报，2002，9（3）：1－4.

［5］ 詹才新，朱兰宝.RAPD技术在金针菇杂交育种中的应用［J］.食用菌学报，1995，2（1）：7－11.