成骨细胞在精－丙－天－丙16自组装多肽水凝胶表面培养的研究

张锋 任灵飞 应永芳 施更生

成骨细胞在精－丙－天－丙16自组装多肽水凝胶表面培养的研究

张锋 任灵飞 应永芳 施更生

目的研究小鼠成骨前体细胞MC3T3－E1在自组装多肽水凝胶材料上黏附、伸展、增殖和分化的能力。方法人工合成短肽精－丙－天－丙16(RADA16)，制备RADA16水凝胶并用扫描电镜观察其微观结构。同时在RADA16多肽水凝胶支架材料上接种MC3T3－E1细胞，观察细胞黏附、伸展、增殖和分化的情况。结果MC3T3－E1细胞能够在多肽水凝胶上黏附、伸展和增殖。成骨诱导培养后的细胞有较高水平的ALP、OC表达及矿化基质沉积，成骨相关基因Runx2，OSX，AKP－2和OC也有高表达，且表达量随着时间的延长而不断升高。结论自组装多肽水凝胶能够支持MC3T3－E1细胞的黏附、伸展、增殖和分化，显示了良好的生物相容性，可能在牙周炎所致的骨质缺损修复中有广泛应用。

多肽水凝胶RADA16成骨细胞

本文将研究自组装多肽水凝胶材料RADA16的微观结构及其生物相容性，检测小鼠成骨前体细胞MC3T3－E1在水凝胶支架材料上的黏附、增殖与分化的能力，为下一步的动物实验提供理论依据。

材料与方法

1．材料及试剂:多肽RADA16由上海波泰公司合成(纯度≥95%);DNA含量测定试剂盒(Invitrogen公司，美国);碱性磷酸酶活性测定试剂盒(Wako公司，日本);骨钙素含量测定试剂盒(Biomedical Technologies公司，美国);实时定量RTPCR试剂盒、引物(TaKaRa公司，日本)。

2．方法:(1)多肽水凝胶的制备:将定制购买的多肽粉末(RADA16)溶于去离子水中配成1%的溶液，接着超声振荡30s，然后将50μl的多肽溶液置于载玻片上和96孔细胞培养板中(分别用于检测水凝胶表征和细胞培养)，以及将200μl的多肽溶液置于24孔细胞培养板中。再接着加入适量的α－MEM培养基来诱导水凝胶的形成。数分钟后，载玻片上及细胞培养板底部有水凝胶形成。(2)细胞培养:MC3T3－E1细胞置于基本培养液中，在37℃、5%CO2和饱和湿度的培养箱中常规培养。每2～3天换液1次，待细胞融合至70%～80%时，用含EDTA的0．25%胰蛋白酶消化传代。将1×104个细胞接种到组装有多肽水凝胶的载玻片和96孔细胞培养板，同时将5×104个细胞接种到组装有多肽水凝胶的24孔细胞培养板。分别培养1、3、24h、3、4、7、14和28天，每3天更换完全培养基1次。为了检测细胞的分化能力，将培养基更换为成骨培养基(添加10mmol/L的β－甘油磷酸和50mg/L的维生素C)。(3)扫描电镜样品的制备及观察:多肽水凝胶材料(其中一半有细胞培养在表面)用2%的戊二醛溶液在4℃条件下固定2h，去离子水冲洗数遍，梯度乙醇溶液脱水各5min，真空冷冻干燥后喷金，扫描电镜观察水凝胶的表面结构。(4)细胞形态观察:将分别培养了1、3、24h及3天的水凝胶支架材料取出，37℃的PBS溶液轻轻漂洗以去除未牢固黏附的细胞，4%多聚甲醛溶液在4℃固定30min，0．1%曲拉通渗透3min，牛血清白蛋白封闭3min;然后用结合有FITC的鬼笔环肽(5μg/ml)在37℃避光的条件下处理50min，最后用50μg/ml的碘化丙啶同样在37℃避光的条件下处理5min，PBS充分漂洗。经过染色的水凝胶材料马上用荧光正置相差显微镜观察并摄片。(5)成骨前体细胞的早期黏附和增殖能力检测:组装有多肽水凝胶的96孔细胞培养板接种细胞后培养一定的时间，于设定的时间点取出接着每孔加入200μl柠檬酸缓冲溶液，置于－80℃低温冰箱保存。等样品收集完毕，用反复冻融法将所有的样品连续冻融3次，收集细胞裂解液，离心，取上清液用于细胞DNA含量测定。本研究采用特定的试剂盒检测总的细胞DNA含量来推测细胞数。根据厂家提供的检测说明，20μl上清液置于96孔细胞培养板中，再用80μl TE工作液稀释，接着加入100μl picoGreen工作液，避光室温孵育2～5min，多光谱酶标仪测量荧光强度(Ex485nm/ Em510nm)。最后，根据标准曲线求出待测样品DNA的含量。(6)碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OC)含量的测定:成骨前体细胞在水凝胶表面分别培养4、7和14天，弃去细胞培养基，用PBS清洗3遍，加细胞裂解液4℃作用15min，收集后12000r/ min 4℃离心15min，取上清。所有样本分别用专用试剂盒检测ALP活性和细胞总蛋白浓度。细胞内ALP活性值均用相应的细胞总蛋白浓度予以校准，以获得相对ALP活性值。关于细胞分泌的骨钙素主要是通过测量细胞培养基中的骨钙素含量来确定的。当培养14天后，收集全部的细胞培养基并记录其体积(ml)，10000r/min 4℃离心15min，取上清测量骨钙素含量。通过特定的骨钙素含量测定试剂盒、采用ELLISA的方法来测定，完全依据试剂商提供的操作步骤进行。所测的骨钙素含量乘以细胞培养基的量得到细胞分泌的骨钙素总量，最后用细胞总蛋白浓度校准。(7)成骨相关基因表达的检测:在成骨培养基中分别培养了4、7和14天后，弃去培养基，PBS清洗3遍，用RNeasy Mini Kit和RNase－Free'DNase Set试剂盒抽提细胞总RNA，经反转录反应合成相应cDNA后，配制实时定量PCR反应体系(共20μl体积)，进行实时荧光定量PCR检测(反应参数均根据试剂盒使用说明)，主要为:95℃，5min 1次循环; 95℃，5s及60℃，34s，共40次循环。管家基因β－actin的表达水平为内参照，对各基因表达水平进行校准。各基因引物情况见表1。(8)茜素红染色检测钙化结节:MC3T3－E1细胞在RADA16多肽水凝胶支架材料表面诱导培养4周后，先吸走全部培养基，接着用PBS冲洗3次，然后在95%的乙醇溶液中固定10min。固定后的细胞用去离子水漂洗2次，接着使用40mmol/L的茜素红溶液(用氨水调至pH 4.2)在室温下染色10min，在倒置相差显微镜下观察和摄片。

表1 实时定量PCR所用引物的信息

结果

1．多肽水凝胶超微结构的观察结果:如图1A所示，多肽水凝胶材料RADA16具有三维网状结构，由大量的纳米纤维结构组成。纳米纤维的直径约为10nm，纳米纤维所形成的网状结构的网孔大小不一，大的有数百纳米，而小的网孔大约只有数十纳米。图1B是MC3T3－E1细胞在RADA16水凝胶材料表面培养3天的SEM图，很明显成骨细胞能够在水凝胶支架材料表面伸展、生长。

图1 多肽水凝胶及成骨细胞在水凝胶表面生长的扫描电镜图

2．多肽水凝胶表面细胞形态的观察结果:如图2所示，培养1h后，MC3T3－E1细胞就开始在多肽水凝胶表面黏附伸展，可以观察到许多细小的细胞伪足;到3h时，细胞铺展的面积明显增大，可以观察到许多粗大的细胞伪足;培养24h后，材料表面的细胞基本上完全伸展，呈现出细长的形态。而培养3天后，成骨前体细胞明显开始分裂增殖，材料表面有大量的细胞重叠生长。

图2 Mc3T3－E1细胞在多肽水凝胶表面培养不同时间的形态学变化

3．多肽水凝胶表面成骨细胞黏附、增殖能力的检测结果:培养1h时，接种的大部分成骨前体细胞已经黏附到多肽水凝胶表面，3h时更多的细胞黏附在材料表面;而到了24h，几乎所有当初接种的细胞全部都黏附到了材料的表面。培养3天后，多肽水凝胶支架材料的表面的细胞增殖到了原来的3倍多，而到第7天，细胞快速增殖了8．5倍。

4．成骨分化相关的蛋白与基因的表达结果:如图3所示，在多肽水凝胶支架材料表面生长的成骨细胞能够表达碱性磷酸酶(ALP，成骨细胞分化的早期指标)，而且其活性随着培养时间的延长而不断增加。诱导培养2周后，细胞培养液中也能够检测到骨钙素的存在(OC，成骨细胞分化的晚期指标)。而关于成骨分化相关基因Runx2、OSX、AKP－2和OC，不仅能够检测到它们的高表达，而且它们的表达量都随着细胞培养时间的增加而不断的提高。

图3 在RADA16多肽水凝胶支架材料表面培养的成骨细胞能够表达碱性磷酸酶(A)和骨钙素(B)

5．茜素红染色的检测结果:茜素红染色通常用于检测细胞外的钙盐沉积，RADA16支架表面MC3T3－E1细胞诱导培养4周经茜素红染色后在水凝胶表面可见许多红染的区域，说明成骨细胞能够在RADA16多肽水凝胶材料表面矿化沉积形成钙结节。

讨论

目前，学者们已经发现和设计合成了一系列特殊的低分子多肽，它们能够自组装形成结构规整的纳米纤维和支架材料。多肽水凝胶支架材料具有良好的生物相容性，能够支持细胞的黏附和生长［6～8］。多肽水凝胶不仅能用于各种细胞的三维培养，而且能够促进局部血管的生成［9］。与现有的支架材料相比，分子自组装多肽水凝胶支架材料具有明显的优势。首先，多肽水凝胶材料具有纳米三维结构，与天然细胞外基质类似，能为细胞生长提供真正的三维环境。同时，水凝胶材料能在体内被相关酶降解为天然氨基酸，能为人体重吸收利用。最后，它们能够人工合成，能够在氨基酸水平改性从而得到更有活性的材料，而且没有免疫原性避免了排斥反应。本研究证实，1%的RADA16水溶液确实在一定条件下能够分子自组装形成水凝胶材料。RADA16多肽是由亲水氨基酸和疏水氨基酸交替形成的极其稳定的折叠结构，然后可自组装成纳米纤维支架的水凝胶。SEM分析证实RADA16水凝胶的微观结构为纳米纤维组成的三维结构，成骨前体细胞MC3T3－E1能够在其上良好的生长，有大量的细胞伪足长入了水凝胶材料的内部，显示了良好的生物相容性。

本研究的实验结果显示，MC3T3－E1细胞能够在RADA16水凝胶材料的表面黏附，伸展和增殖。成骨前体细胞在RADA16表面生长一段时间后能够表达ALP、OC蛋白和形成钙化结节，而ALP、OC和钙化结节分别是成骨细胞分化的早期、晚期指标和终末指标，这也说明MC3T3－E1细胞能够在RADA16表面分化和功能表达［10，11］。Runx2与OSX共同调控着ALP、OC、Colla1、OPN、BSP等基因的表达，不仅影响成骨细胞的分化，而且也调节者成骨细胞的功能。而本研究的结果表明，在RADA16表面生长的成骨细胞能够表达Runx2、OSX、ALP及OC等成骨分化相关基因，而且它们的表达量随着时间的延长而不断提高。这也从另一方面说明在RADA16水凝胶支架材料表面生长的MC3T3－E1细胞能够进行成骨分化和功能表达。

自组装多肽水凝胶纳米纤维支架材料近年来越来越受到学者们的关注，这些特殊的0．1%～1．0%多肽溶液在一定的pH值和离子浓度下能够自发地自组装成水凝胶。同时这类多肽水凝胶含有超过99%的水容量，由直径约为10nm的纤维组成三维网状结构，内部的孔隙大小为5～200nm。我们认为，这种多肽水凝胶材料将会在牙科领域得到广泛的应用，特别是牙周疾病引起的骨质缺损的修复治疗。因为这类骨质缺损的形状往往是极不规则的，而且缺损骨质的体积相对较小。多肽水凝胶材料高度含水(≥99%)，凝胶形成前的水溶液状态能够填满任何形状的骨质缺损空间，然后自组装形成凝胶充满整个缺损间隙。虽然多肽水凝胶的力学强度相对较弱，但是当位于牙根周围时它不会受到很大的外力作用。多肽水凝胶的这种原位自组装性质是非常关键的，因为其他绝大部分的生物材料并不能与炎症或外伤所致的不规则缺损形状相匹配。最近有研究认为，多肽水凝胶材料还是一种良好的缓释载体系统［12］，如果在水凝胶内部携带BMPs或抗生素，相信对牙周病的治疗大有裨益。

1Kopesky PW，Vanderploeg EJ，Sandy JS，et al．Self－assembling peptide hydrogels modulate in vitro chondrogenesis of bovine bone marrow stromal cells［J］．Tissue Eng Part A，2011，16(2):465－477

2Phillips MJ，Otteson DC．Differential expression of neuronal genes in Muller glia in two－and three－dimensional cultures［J］．Invest Ophthalmol Vis Sci，2011，52(3):1439－1449

3Zhao M，Song C，Zhang W，et al．The three－dimensional nanofiber scaffold culture condition improves viability and function of islets［J］．J Biomed Mater Res A，2011，94(3):667－672

4Zhou M，Smith AM，Das AK，et al．Self－assembled peptide－based hydrogels as scaffolds for anchorage－dependent cells［J］．Biomaterials，2009，30(13):2523－2530

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6Galler KM，Aulisa L，Regan KR，et al．Self－assembling multidomain peptide hydrogels:designed susceptibility to enzymatic cleavage allows enhanced cell migration and spreading［J］．J Am Chem Soc，2011，132(9):3217－3223

7Ozeki M，Kuroda S，Kon K，et al．Differentiation of bone marrow stromal cells into osteoblasts in a self－assembling peptide hydrogel:in vitro and in vivo studies［J］．J Biomater Appl，2011，25(7):663－684

8Genove E，Shen C，Zhang S，et al．The effect of functionalized selfassembling peptide scaffolds on human aortic endothelial cell function［J］．Biomaterials，2005，26(16):3341－3351

9Davis ME，Motion JP，Narmoneva DA，et al．Injectable self－assembling peptide nanofibers create intramyocardial microenvironments for endothelial cells［J］．Circulation，2005，111(4):442－450

10Fung SY，Yang H，Chen P．Sequence effect of self－assembling peptides on the complexation and in vitro delivery of the hydrophobic anticancer drug ellipticine［J］．PLoS One，2008，3(4):e1956

11Bancroft GN，Sikavitsas VI，van den Dolder J，et al．Fluid flow increases mineralized matrix deposition in 3D perfusion culture of marrow stromal osteoblasts in a dose－dependent manner［J］．Proc Natl Acad Sci U S A，2002，99(20):12600－12605

12Nagai Y，Unsworth LD，Koutsopoulos S，et al．Slow release of molecules in self－assembling peptide nanofiber scaffold［J］．J Control Release，2006，115(1):18－25

(收稿:2011－09－18)

(修回:2011－12－01)

Study of Osteoblast Cultured on the Surface of RADA16 Self－assembling Peptide Hydrogel．

Zhang Feng，Ren Lingfei，Ying Yongfang，Shi Gengsheng．Taizhou Hospital of Zhejiang Province，Zhejiang 317100，China

ObjectiveTo investigate the ability of attachment，spreading，proliferation and differentiation of mouse pre－osteoblasts，MC3T3－E1，on RADA16 self－assembling peptide hydrogel．MethodsRADA16 peptide was custom synthesized．RADA16 peptide hydrogel was prepared and SEM was used to explore its ultra－structure．Then，MC3T3－E1 cells were seeded on RADA16 peptide hydrogel．Cell attachment，cell spreading，cell proliferation and cell differentiation were evaluated．ResultsMC3T3－E1 cells adhered and spread well on RADA16 peptide hydrogel．High ALP activity，OC production，calcium depositon and expressions of bone－related genes(Runx2，OSX，AKP－2，OC)were detected，and their expressions were increased with the culture time．ConclusionSelf－assembling peptide scaffold can support pre－osteoblast attachment，spreading，proliferation and differentiation and show good compatibility．This kind of peptide scaffold might have a wide application in dentistry，especially the treatment of bone defects caused by periodontal disease．

Peptide hydrogel;RADA16;Osteoblast

牙周病是人类口腔中两大最常见的疾病之一，也是成年人牙齿缺失的首要原因。根据2005年第3次全国口腔健康流行病学调查结果显示:我国80%～97%的成年人患有不同程度的牙周疾病。牙周病的治疗方法不少，但是牙周组织的恢复尤其是牙周支持骨的恢复一直没有得到很好的解决。最近有一种新型的多肽自组装纳米纤维支架材料被广泛用于细胞培养和组织修复［1～4］。这些低分子多肽水溶液(0.1%～1.0%)，能够在一定条件下(温度、pH值、离子浓度等)自发的形成稳定的和具有一定强度的水凝胶支架材料［5］。根据这种特性，可以使之在体外为溶液状态而在体内为凝胶状态，从而实现可注射性。由于牙周病引起的骨组织缺损形状复杂且非常不规则，可注射水凝胶修复材料具有尤其明显的优越性，通过注射的方法将具有一定流动性的生物材料种植体内，原位成型，因此很容易充满整个具有不规则形状的缺损部位，手术创伤非常微小。

2007年浙江省科技厅基金资助项目(2007C 23016)

317100临海，浙江省台州医院

施更生，电子信箱:painfulzf@yahoo．cn