太白楤木抗肝损伤作用药效物质基础的初步研究

郭东艳 覃鸿恩 李瑾 吕杨 师延琼

太白楤木抗肝损伤作用药效物质基础的初步研究

郭东艳 覃鸿恩 李瑾 吕杨 师延琼

目的初步确定太白楤木抗肝损伤作用的药效物质基础。方法采用经典的系统溶剂法(极性由小到大:石油醚－氯仿－乙酸乙酯－正丁醇)依次对太白楤木提取液进行萃取，将各提取液分别灌胃给予四氯化碳(CCl4)致急性肝损伤模型小鼠，检测血清及肝组织中丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、超氧化物歧化酶(SOD)的活性和丙二醛(MDA)、谷胱苷肽过氧化物酶(GSH－Px)的水平，比较各部位的抗肝损伤作用;将筛选出的活性部位用大孔吸附树脂进行分离纯化，不同浓度乙醇进行梯度洗脱，洗脱液分别灌胃给予肝损伤模型小鼠，检测血清及肝组织中ALT、AST、SOD的活性和MDA、GSH－Px的水平，比较各洗脱部位的抗肝损伤作用。结果与模型对照组比较，正丁醇部位可明显降低CCl4引起的ALT、AST、MDA升高，增加肝组织中SOD的活性和GSH－Px的水平;70%乙醇洗脱的正丁醇提取物可明显降低CCl4引起的ALT、AST、MDA升高，增加肝组织中SOD的活性和GSH－Px的水平，且洗脱液剂量与保肝作用有明显的正相关性。结论太白楤木保肝作用的药效活性物质大多存在于70%乙醇洗脱的正丁醇部位，其抗肝损伤作用的活性成分可能与该部位主要成分皂苷类有关。

太白楤木抗肝损伤有效部位

太白楤木(Aralia taibaiensis)又名飞天蜈蚣七，系五加科楤木属多年生植物，分布于我国的西部地区，有着非常丰富的野生资源［1］。主要以根皮入药，用于各种肝炎、肝硬化腹腔积液、消渴、跌打损伤及风湿痹痛等证［2］。近年来的药理实验研究表明太白楤木具有确切的保肝作用［3，4］。本实验采用四氯化碳致小鼠急性肝损伤模型，对太白楤木不同极性部位提取物进行保肝作用的药效学研究，并结合大孔树脂分离技术筛选太白楤木保肝有效部位，为进一步深入研究太白楤木保肝的药效物质基础及作用机制奠定基础［5］。

材料与方法

1．材料与仪器:(1)动物:5～6周龄洁净级昆明种小鼠，雌雄各半，体重20±2g，由西安交通大学动物实验中心提供，动物生产许可证号:SCXK(陕)2007－001。(2)药物:太白楤木药材购于陕西眉县药材公司，经本院王继涛高级实验师鉴定为五加科植物楤木属(Aralialinn)太白楤木(Aralia taibaiensis)的根皮。联苯双酯滴丸(浙江医药有限公司新昌制药厂，批号:20100519);ALT、AST试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司;MDA、SOD、GSH－Px试剂盒购自南京建成生物工程研究所。所用试剂均为分析纯。(3)仪器:XYJ－2式台式高速离心机(江苏恒丰仪器厂生产);UV1102紫外分光光度计(上海天美科学仪器有限公司生产);XD811半自动生化分析仪(上海医疗仪器公司生产);JJQ－P2016J生物组织切片机(武汉俊杰电子有限公司生产)。

2．方法:(1)系统溶剂法提取部位:称取太白楤木药材1kg，8倍量80%乙醇回流提取2次，每次2h，回收乙醇，药渣加8倍量水煎煮两次，每次2h。合并醇提液和水提液，浓缩至约1000ml。采用系统溶剂法，按溶剂极性从小到大依次萃取，得到石油醚提取物、氯仿提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物和萃取后剩余水相。各部位提取物加适量0．5%CMCNa蒸馏水溶液研磨配置成混悬液(每毫升相当于原药材0.3g)，备用。(2)大孔吸附树脂提取分离部位:取一定量正丁醇部位加水适量稀释，加于已处理好的HPD100型大孔树脂柱上，控制吸附流速为1BV/h，然后用4BV的去离子水除杂，再分别用2BV的30%、70%、90%乙醇以1BV/h的流度洗脱，收集洗脱液，回收乙醇后继续减压浓缩成稠膏，60℃烘箱干燥，分别称重，即得楤木提取物［6，7］。再将上述不同浓度洗脱物配制成高中低浓度溶液(每毫升分别相当于原药材1、0．5、 0.25g)，备用。(3)抗肝损伤作用实验研究［8，9］:1)系统溶剂法提取各部位对CCl4引起的急性肝损伤小鼠肝功能的影响:取洁净级昆明种小鼠96只，雌雄各半，体重20±2g，按体重随机分为8组，每组12只，雌雄分开饲养。适应性饲养5天，联苯双酯组按0．6g/kg给药，正常对照组和模型组灌胃等体积的生理盐水，其余各组均按0．4毫升/(天·只)剂量进行灌胃给药，连续灌胃7天。末次给药后2h，将CCl4溶于精制花生油中，配成0．1%的CCl4花生油溶液，按0．1ml/10g进行腹腔注射，建立小鼠急性肝损伤模型，正常对照组腹腔注射等量生理盐水，禁食不禁水，16h后摘眼球取血，3500r/min离心10min，上清液保存备用。同时立即剖取肝脏，取0．5g肝组织，剪碎，放于玻璃匀浆器中，加预冷的9倍体积的0．9%生理盐水，2500r/min离心10min，上清液保存备用［7］。血清生化指标ALT、AST的测定均按试剂盒说明书具体步骤进行，用半自动生化分析仪进行测定。肝组织生化指标SOD、GSH－Px、MDA的测定均按试剂盒说明书具体步骤进行，用紫外分光光度计进行测定。2)大孔吸附树脂分离部位对CCl4引起的急性肝损伤小鼠的影响:取洁净级昆明种小鼠96只，雌雄各半，体重20±2g，按体重随机分为8组，每组12只，雌雄分开饲养。适应性饲养5天，联苯双酯组按0．6g/kg给药［6］，正常对照组和模型组灌胃等体积的生理盐水，其余各组均按0．4毫升/(天·只)剂量进行灌胃给药，连续灌胃7天。处理方法用系统溶剂法。

结果

1．系统溶剂法提取各部位对CCl4引起的急性肝损伤小鼠肝功能的影响:用半自动生化分析仪进行测定血清生化指标ALT、AST，紫外分光光度计测定肝组织生化指标SOD、GSH－Px、MDA。结果见表1、表2。实验结果表明，模型组的各指标水平相对空白对照组均有显著性差异(P＜0．01)。正丁醇提取物组能明显降低CCl4引起的ALT、AST、MDA升高，增加肝组织中SOD的活性和GSH－Px的水平，具有显著性差异(P＜0．01);氯仿组能降低ALT、AST和MDA水平、增加GSH－Px的水平。石油醚、乙酸乙酯及萃取后剩余的水相则作用不明显。

2．大孔吸附树脂分离部位对CCl4引起的急性肝损伤小鼠的影响:用半自动生化分析仪进行测定血清生化指标ALT、AST，紫外分光光度计测定肝组织生化指标SOD、GSH－Px、MDA。结果见表3、表4。

表1 各提取部位对CCl4引起的急性肝损伤小鼠血清转氨酶活性的影响±s，n=12，U/L)

表1 各提取部位对CCl4引起的急性肝损伤小鼠血清转氨酶活性的影响±s，n=12，U/L)

与对照组比，*P＜0．01;与模型组相比，△P＜0．05，△△P＜0．01

ALTAST空白对照组组别493．25±24．52368．75±40．65 38．83±4．4976．58±11．39 CCl4模型组515．25±37．11*385．92±30．56*联苯双酯组285．25±27．45△△253．50±54．27△△石油醚组492．75±30．85370．17±23．09氯仿组480．58±33．24△359．67±24．83△乙酸乙酯组483．58±37．79366．83±25．34正丁醇组359．17±37．84△△307．33±38．87△△剩余水相组

表2 各提取部位对CCl4引起的急性肝损伤小鼠肝组织SOD、GSH－Px、MDA的影响±s，n=12)

表2 各提取部位对CCl4引起的急性肝损伤小鼠肝组织SOD、GSH－Px、MDA的影响±s，n=12)

与对照组比，*P＜0．01;与模型组相比，△P＜0．05，△△P＜0．01

组别MDA(nmol/g)GSH－Px(U/mg)SOD(U/mg) 52．05±12．43182．48±46．38200．45±21．36 CCl4模型组265．41±29．76*77．58±17．17*78．84±26．51＊＊联苯双酯组121．92±19．19△△119．02±25．51△△158．94±28．97△△石油醚组260．85±29．9587．80±23．8990．54±37．03氯仿组233．56±29．48△97．93±18．76△107．44±38．72乙酸乙酯组249．15±29．0390．69±20．32100．77±35．57正丁醇组129．01±20．21△△106．53±17．72△△141．43±44．07△△剩余水相组空白对照组237．24±43．2592．33±21．4894．22±25．17

讨论

肝脏是人体内最大的实质器官，结构和功能复杂，易受多种病原体、毒物及免疫病理累及。四氯化碳进入肝细胞后，使线粒体膜的脂质溶解，从而影响线粒体的结构和功能，使酶蛋白质合成减少，造成酶的破坏，因而影响代谢功能和能量的生成，致使肝细胞的变性、坏死。本实验通过采用经典的系统溶剂法并结合大孔树脂分离技术，对太白楤木抗肝损伤作用进行了初步研究，结果表明:正丁醇部位可显著降低CCl4引起的ALT、AST、MDA升高，增加肝组织中SOD的活性和GSH－Px的水平，氯仿、石油醚等部位作用不明显。因此初步分析:正丁醇部位所含成分可能为太白楤木抗肝损伤作用的主要活性成分。对正丁醇部位进一步进行大孔树脂分离，分别得到不同醇浓度洗脱部位，结果表明70%乙醇洗脱部位大中小剂量组均能显著降低CCl4引起的ALT、AST、MDA升高，增加肝组织中SOD的活性和GSH－Px的水平，且剂量与保肝作用有明显的正相关，结合太白楤木中的主要化学成分为皂苷类，因此初步判断太白楤木中皂苷含量的高低与抗肝损伤作用可能有一定的相关性，其活性成分的确定及作用机制还有待于进一步试验。

表3 不同浓度的各洗脱部位对CCl4引起的急性肝损伤小鼠血清转氨酶活性的影响±s，n=12，U/L)

表3 不同浓度的各洗脱部位对CCl4引起的急性肝损伤小鼠血清转氨酶活性的影响±s，n=12，U/L)

与对照组比，*P＜0．01;与模型组相比，△P＜0．05，△△P＜0．01

38．75±4．1373．83±9．03模型组292．58±45．01*310．50±38．40*阳性组114．83±19．30△△186．58±29．84△△30%乙醇高剂量252．25±28．54△275．42±21．21△30%乙醇中剂量258．92±37．64282．50±24．01 30%乙醇低剂量273．25±31．92286．42±21．56 70%乙醇高剂量138．75±21．46△△147．50±26．95△△70%乙醇中剂量187．92±26．70△△200．42±38．92△△70%乙醇低剂量205．83±25．52△△233．67±29．39△△90%乙醇高剂量277．50±22．63286．58±18．85 90%乙醇中剂量280．08±22．05293．17±23．23 90%乙醇低剂量ALTAST空白组组别281．92±28．10300．67±23．05

实验结果表明:模型组的各指标水平相对空白对照组均有显著性差异(P＜0．01)。70%乙醇洗脱液各剂量均能明显降低CCl4引起的ALT、AST、MDA升高，增加肝组织中SOD的活性和GSH－Px的水平，具有显著性差异(P＜0．01)，;30%乙醇洗脱部位的高剂量组能降低CCl4引起的ALT、AST升高，增加肝组织中SOD的活性及GSH－Px的水平(P＜0．05)，90%乙醇洗脱部位作用不明显。

表4 不同浓度的各洗脱部位对CCl4引起的急性肝损伤小鼠肝组织SOD、GSH－Px、MDA的影响±s，n=12)

表4 不同浓度的各洗脱部位对CCl4引起的急性肝损伤小鼠肝组织SOD、GSH－Px、MDA的影响±s，n=12)

与对照组比，*P＜0．01;与模型组相比，△P＜0．05，△△P＜0．01

组别MDA(nmol/g)GSH－Px(U/mg)SOD(U/g) 37．92±7．91186．90±35．12177．37±27．33模型组128．66±26．84*93．51±36．17*82．12±33．20*阳性组50．44±11．62△△159．84±23．99△△142．95±17．92△△30%乙醇高剂量109．49±15．15123．72±26．42△114．74±28．89△30%乙醇中剂量110．53±17．88117．09±11．69111．63±39．72 30%乙醇低剂量112．05±22．25109．80±12．13103．37±44．28 70%乙醇高剂量71．70±8．81△△151．86±25．20△△137．44±27．70△△70%乙醇中剂量77．49±6．61△△137．62±21．01△△127．89±12．87△△70%乙醇低剂量84．23±11．31△△128．75±14．71△△119．42±19．11△△90%乙醇高剂量110．57±23．46110．37±23．8494．32±20．46 90%乙醇中剂量111．25±20．89108．28±15．3691．80±21．67 90%乙醇低剂量空白组115．86±15．96102．67±16．3792．63±30．67

1孙碌．楤木的价值及资源保护［J］．特产研究，1991，(2):50

2王忠壮，张凤春，苏中武，等．太白楤木的生药学研究及化学成分分析［J］．中国药学杂志，1995，30(4):199

3崔大江，郅敏，聂丹丽．飞天蜈蚣七对实验性肝纤维化大鼠胰岛β细胞功能的影响［J］．河北中医药学报，2004，19(1):21－23

4崔大江，聂丹丽，衣蕾．太白楤木对大鼠肝星状细胞核因子－κB活性表达的影响［J］．辽宁中医药大学学报，2010，12(4):48－49

5李仪奎．中药药理实验方法学［M］．上海:上海科学技术出版社，1991

6郭东艳，卢雪梅．太白楤木总皂苷纯化工艺研究［J］．陕西中医学院学报，2009，32(4):65－67

7张丽娟．生地黄止血物质基础及海绵剂制备工艺研究［D］．咸阳:陕西中医学院，2011

8周程艳，余海平，陶志彬，等．杜仲水提物对四氯化碳所致小鼠肝损伤的保护作用［J］．时珍国医国药，2009，20(9):2321－2323

9冯天艳，方荣，邓改改，等．根皮苷对小鼠CCl4急性肝损伤的保护作用［J］．中药药理与临床，2010，26(5):47－49

(收稿:2012－02－10)

(修回:2012－02－27)

Preliminary Study on Pharmacodynamic Material Basis of Aralia Taibaiensis in Anti－hepatic Injury．

Guo Dongyan，Qin Hongen，Li Jin，Lv Yang，Shi Yanqiong．The Medicine College of Shaanxi University of Chinese Medicine，Shaanxi 712046，China

ObjectiveTo study the pharmacodynamic material basis of Aralia taibaiensis in anti－hepatic injury．MethodsThe experimental drugs were systematically extracted by solutions method(petroleum ether，chloroform，ethyl acetate，N－buoh)from Aralia taibaiensis according to solutions'polarity．The mice model of acute liver injury was established by carbon tetrachloride．Activities of ALT，AST，SOD were examined，and levels of MDA，GSH－Px were determined．The hepatic histological changes were observed by optical microscope．The effect of anti－hepatic injury was compared．The effective part was in macroporous adsorption resin to purification，with different concentration gradient itself on ethanol．Then the Same procedures were as above．And the effect of anti－hepatic injury was compared in each elution part．ResultsCompared with model control group，N－buoh extract of Aralia taibaiensis could significantly de-crease the ALT，AST，MDA activities by carbon tetrachloride，improve SOD activity and GSH－Px level．Pathological results showed that N－buoh extract of Aralia taibaiensis could significantly reduce the liver injury induced by carbon tetrachloride．The elution things by 70%ethanol from N－buoh extract could significantly decrease the ALT，AST，MDA activities by carbon tetrachloride，improve SOD activity and GSH－Px level．Dosages of eluent were positively related to anti－hepatic injury．ConclusionThe effective parts for anti－hepatic injury exist mostly at the part of 70%ethanol from N－buoh extract．The active ingredients of anti－hepatic injury might be combined with it's saponins ingredients．

Aralia taibaiensis;Anti－hepatic injury;Effective composition

陕西省教育厅资助项目(09JS015，2010JK506);陕西省中管局资助项目(ZY30，ZY31)

712046西安，陕西中医学院药学院