PSMA靶向性小分子谷氨酸尿素类似物Glu-urea-Lys的合成

陈骁驰，杨德勇，车翔宇，王建伯，陈 峰，宋希双

(大连医科大学附属第一医院泌尿外科，辽宁大连 116011)

PSMA靶向性小分子谷氨酸尿素类似物Glu-urea-Lys的合成

陈骁驰，杨德勇，车翔宇，王建伯，陈 峰，宋希双

(大连医科大学附属第一医院泌尿外科，辽宁大连 116011)

［目的］探索前列腺特异性膜抗原(PSMA)靶向性谷氨酸尿素小分子的合成。［方法］按照标准的无水无氧操作技术进行实验操作;应用核磁共振光谱仪与高分辨质谱仪进行化合物成分测定分析。［结果］经核磁共振波普法与质谱法分析，确认得到以谷氨酸尿素为结构基础的小分子化合物Glu-urea-Lys。［结论］以Glu-urea-Lys为基础结构的研究，将为前列腺癌分子影像学诊断及靶向治疗领域提供理论依据与实验基础。

PSMA;Glu-urea-Lys;前列腺癌

前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen，PSMA)是位于前列腺上皮细胞表面的II型跨膜糖蛋白。PSMA在正常前列腺以及前列腺增生细胞表面有所表达，在绝大多数前列腺癌细胞中其表达明显上调［1］。PSMA具有叶酸水解酶及N-乙酰基化α-连接的酸性二肽酶 (NAALADase)活性，能够通过网格蛋白依赖性内吞机制产生内化效应。虽然PSMA调控前列腺癌恶性表型的分子机制尚不明确，与前列腺癌侵袭、转移、分期、分级等临床参数之间的关系仍有争议，但PSMA在前列腺癌细胞表面特异性高表达的生物学特征及内化效应，使其在前列腺癌分子影像学及靶向治疗领域具有极为重要的研究价值［2］。已有研究表明，核素等物质标记的PSMA单克隆抗体在前列腺癌的分子影像学诊断及靶向治疗方面显示出一定的临床应用前景［3-4］。然而，PSMA 单克隆抗体属于大分子蛋白类物质，对前列腺癌肿瘤实质，尤其对淋巴结转移以及骨转移前列腺癌的渗透性差，循环半衰期长，与非特异性组织结合后清除速度慢，体内应用副作用较大，容易引起免疫应答反应，而且单克隆抗体生产成本高，保存过程中生物活性容易发生改变，因此限制了其在前列腺癌诊断及治疗中的应用。

为了改进前列腺癌的诊断及治疗方法，近年来研究人员开发出一系列PSMA靶向性小分子物质，可以特异性作用于前列腺癌细胞。谷氨酸尿素小分子及其类似物(Glu-urea-R)是叶酸水解酶I活性抑制剂，同时能够竞争性抑制PSMA的NAALADase酶活性，因此能够高效、靶向的与前列腺癌细胞表面的PSMA相结合，并且通过内化作用进入到前列腺癌细胞内。在Glu-urea-R的空间结构中，Gluurea为PSMA绑定端，R基团为其它化学基团偶联端。与PSMA的单克隆抗体相比，Glu-urea-R生物学活性稳定，体内循环半衰期短，对于肿瘤实质以及肿瘤转移灶渗透性好，体内应用副作用低。研究表明，某些生物制剂与分子影像学显象剂可以与Glu-urea-R结合，靶向作用于前列腺癌细胞，例如脂质体、反义核苷酸、免疫与蛋白制剂、治疗性siRNA、核素等。作为PSMA靶向性的小分子物质，Glu-urea-R具有便于合成及纯化、易于连接其它物质、易溶于水、能够稳定储存等特点。Gluurea-R在前列腺癌分子影像学及靶向治疗方面具有极高的应用价值，目前国内尚缺乏PSMA靶向性谷氨酸尿素小分子研制的报道。本文以赖氨酸(Lys)替换R集团，探讨Glu-urea-Lys的合成。

1 材料和方法

1.1 分子筛

用于干燥有机溶剂的4A或5A分子筛，必须先经过活化:将其在马弗炉中400℃煅烧4 h，然后置于干燥器中冷却至室温备用。

1.2 溶 剂

将二氯甲烷先经过5A分子筛浸泡后，在高纯氮气的保护下，以CaH2作为除水剂，加热回流6 h。常压蒸出，保存于Schlenk瓶中备用。

1.3 实验仪器

1.3.1 核磁共振光谱仪:Varian INOVA 400 MHz核磁共振光谱仪:化学位移(δ)单位为ppm，耦合常数(J单位为Hz。峰形表示为:s=单峰，d=双峰，t=三重峰，m=多重峰，br=宽峰。

1.3.2 高分辨质谱:液相色谱/四级杆飞行时间串联质谱仪:HPLC/Q-Tof MS(英国 Micromass公司)。双正交设计的ZSprayTM大气压电离源，四级杆质量过滤器，Q-Tof分析器。电喷雾离子源，操作正离子模式。

1.4 实验路线

见式1。

式1 目标化合物的合成路线Scheme 1 synthetic route to the title compound

1.5 实验方法

如没有特殊说明，本实验操作均在无水无氧条件下，按照标准的Schlenk技术规范进行。

将固体光气(290 mg，1 mmol)用无水二氯甲烷(6 mL)溶于装有恒压漏斗的三口圆底烧瓶中，形成悬浊液，并将反应液冷却至0℃。

在恒压漏斗中加入溶有化合物1(1.008 g，2.7 mmol)和 N，N - 二异丙基乙胺(1.3 mL，7 mmol)的二氯甲烷((5 mL)溶液。

保持反应液0℃，将恒压漏斗中的溶液滴加到三口瓶中，50 min左右滴加完毕，继续搅拌30 min。

将化合物2(0.8 g，2.7 mmol)和 N，N - 二异丙基乙胺(1.04 mL，6 mmol)的二氯甲烷(5 mL)溶液，一次性加入到三口瓶中，保持0℃继续搅拌30 min。

反应液用30 mL水稀释，二氯甲烷(3×30 mL)萃取，有机相用50 mL饱和食盐水洗涤，并用无水硫酸钠干燥得到黄色油状物，柱层析(石油醚∶乙酸乙酯 =5∶1至2∶1)分离，得到白色固体化合物3;所得化合物3经核磁共振波普法与质谱法进行成分分析测定。

将化合物3(1.32 g，2.13 mmol)溶于乙醇(15 mL)中，加入甲酸铵(1.32 g，10 eqv.)于反应液中，然后加入Pd-C(10%，260 mg)，室温搅拌过夜至完全。反应液用硅藻土过滤后，滤饼用乙醇洗(4×8 mL)，浓缩得到粗产物1.07 g。柱层析(二氯甲烷∶甲醇 =30∶1至8∶1)分离，得到油状物化合物4。所得化合物4经核磁共振波普法与质谱法进行成分分析测定。

2 结 果

化合物3(1.37 g，82%)，作为最终产物4的原料，性状为白色固体，为了确定化合物3的结构的正确性，对其进行了核磁共振波谱分析和高分辨质谱分析。其中氢原子(H)核磁共振波谱的数据如下:氢-核磁共振(1H NMR)(400兆赫兹(MHz)，氘代氯仿(CDCl3))δ 7.40 -7.27(m，5H)，5.37 -5.30(m，3H)，5.11(d，J=10.2 Hz，2H)，4.38 -4.31(m，2H)，3.19 -3.14(m，2H)，2.31 -2.25(m，2H)，2.06 -2.03(m，1H)，1.90 -1.40(m，34H)(图1)。液相色谱/四级杆飞行时间串联质譜仪对分子结构的质量分析，高分辨质谱(ESMS)显示为:质核比(m/z)为:622(M+H)+。

从1H NMR可以看出，分子中有 51个氢。1.40-1.90处中有27个氢是化合物3中的叔丁基的特征峰;7.27-7.40处出现的5个氢，属于苄基芳环的氢;5.11处出现的氢为苄基碳上面的氢;而4.31-4.38 与 3.14 -3.19 处的峰为结构中与氮(N)相连的碳上面的氢，这种氢相对于其他非邻近N的碳上面的氢，化学位移要往低场移一些;N上面的氢的峰出现在5.30-5.37处。

通过高分辨质谱，测出产物的分子量为622，液相色谱/四级杆飞行时间串联质譜仪的电离源为电喷雾离子源，电离方式为软电离，这样必须额外加上一个氢的正电荷，才能在液质联用的质谱中出峰，所以实际的分子量为621。

综合1H NMR和高分辨质谱的测试，可以确定合成出的化合物3正确。

化合物4(550 mg，53%)，为油状物，为了确定化合物3的结构的正确性，对其进行了核磁共振波谱分析和高分辨质谱分析。其中H核磁共振波谱的数据如下:1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ 4.32-4.29(m，2H)，3.08 -3.01(m，4H)，2.84 -2.80(m，2H)，2.35 -2.29(m，2H)，2.08 -2.06(m，1H)，1.86 -1.42(m，34H)(图2)。液相色谱/四级杆飞行时间串联质譜仪对分子结构的质量分析，高分辨质谱(ESMS)显示为:m/z:488(M+H)+。

从1H NMR可以看出，分子中有 45个氢。1.42-1.86处中有27个氢是化合物4中的叔丁基的特征峰;在原料化合物3中，7.27-7.40处出现的5个氢和5.11处出现的氢在化合物4的谱图中均消失了，证明反应确实是脱掉了氨基上面的苄基，脱掉苄基正是这一步反应的目的;3.01-3.08处出现的4个氢为分子中氨基上面的氢;而4.29-4.32与3.01-3.08处的峰为结构中与氮(N)相连的碳上面的氢。

通过高分辨质谱，测出产物的分子量为488，液相色谱/四级杆飞行时间串联质譜仪的电离源为电喷雾离子源，电离方式为软电离，这样必须额外加上一个氢的正电荷，才能在液质联用的质谱中出峰，所以实际的分子量为487。

综合1H NMR和高分辨质谱的测试，可以确定合成出的化合物4正确。

图1 化合物3的1H-NMR谱图Fig 1 The1H-NMR spectra of compound 3

图2 化合物4的1H-NMR谱图Fig 2 The1H-NMR spectra of compound 4

3 讨 论

前列腺癌是泌尿系统常见的恶性肿瘤，据世界卫生组织统计，在男性人群中前列腺癌是仅次于肺癌的第二常见肿瘤，占男性恶性肿瘤的10%［5］。前列腺癌微病灶的早期发现及肿瘤靶向治疗对患者的存活率有着深远影响。尽管传统影像学方法(B超、CT、MRI)的灵敏性与精确度取得了长足的进步，但是仍然较难对早期微小前列腺癌作出明确的诊断;临床上更缺乏前列腺癌靶向性化疗药物的应用。近年来，PSMA靶向性谷氨酸尿素小分子及其类似物在前列腺癌分子影像学诊断及靶向治疗中的作用正日益受到关注。

Maresca等［6］设计、合成了若干易于被核素123I，131I标记的Glu-urea-R，并认为R基团以及与其偶联底物的化学性质可以显著影响Glu-urea-R与 PSMA的亲和力。Kularatne等［7］将 Gluurea-R与99mTc-Dap-Asp-Cys螯合物进行偶联得到可能用于SPECT诊断前列腺癌的分子影像学探针;而将Glu-urea-R与化疗药物TubH相结合可以在体外细胞实验中杀死PSMA阳性表达的LNCaP细胞。Zhang等［8］将 Glu-urea-R 与 DNP偶联，通过Glu-urea端靶向识别前列腺癌，通过DNP端募集体内免疫杀伤相关抗体以期望对前列腺癌起到靶向免疫治疗的作用。研究表明Glu-urea-R中的R集团可以被不同的氨基酸所替代，例如以谷氨酸尿素酪氨酸为结构基础的［125I］DCIT，以谷氨酸尿素半胱氨酸为结构基础的［11C］DCMC与［18F］DCFBC，以谷氨酸尿素赖氨酸为结构基础的［99mTc］L1等，这些小分子物质都对PSMA显示出高特异性与亲和力。由于许多生物制剂与分子影像学显象剂能够通过ε氨基与Lys-C(O)-Glu结构相连接，因此以Lys替换Glu-urea-R中的R集团在前列腺癌分子影像学诊断及靶向治疗领域中有着广阔的研究前景。

目前，国内尚缺乏PSMA靶向性谷氨酸尿素小分子及其类似物研制的报道。本课题组应用固体光气等原料，在无水无氧条件下，按照标准的Schlenk技术规范操作，最终得到油状物化合物，经核磁共振波普法与质谱法分析，确认此物质为目的化合物Glu-urea-Lys;研究表明，在 Glu-urea-R结构中，当R基团含有第三羧基时，Glu-urea-R能够高亲和性的绑定到PSMA的活性位点，而Lys可以提供自由的第三羧酸官能团，因此Glu-urea-Lys小分子能够靶向性与PSMA相结合。根据Gluurea-Lys易于连接其他化学基团的结构特点及其能够靶向性绑定前列腺特异性膜抗原PSMA的分子生物学属性，本课题组在今后的实验中将以此为基础，应用正电子核素标记Glu-urea-Lys，探索高灵敏性、高特异性的前列腺癌PET/CT分子探针的合成方法，研究其对前列腺癌PET/CT的成像特征;并进一步将Glu-urea-Lys从分子影像学延伸至前列腺癌基因、药物靶向治疗领域，为前列腺癌的早期诊断，术前分期，术后复发再分期，前列腺癌的靶向治疗以及靶向治疗患者的选择、疗效评估与监测提供新的策略。

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［2］Wang W，Mo ZN.Advances in prostate-specific membrane antigen targeted therapies for prostate cancer［J］.Zhonghua Nan Ke Xue，2010，16:547-551.

［3］David KA，Milowsky MI，Kostakoglu L，et al.Clinical utility of radiolabeled monoclonal antibodies in prostate cancer［J］.Clin Genitourin Cancer，2006，4:249 -256.

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Synthesis of PSMA-targeted small molecule Glu-urea-Lys analogue

CHEN Xiao-chi，YANG De-yong，CHE Xiang-yu，WANG Jian-bo，CHEN Feng，SONG Xi-shuang
(Department of Urinary Surgery，the First Affiliated Hospital of Dalian Medical University，Dalian116011，China)

Abstract:［Objective］To search for the synthetic method of PSMA-targeted small molecule Glu-urea-Lys analogue.［Methods］All reactions are carried out in dry glassware under an atmosphere of anaerobic conditions for experimental operation.We use nuclear magnetic resonance spectrometer and high-resolution mass spectrometer to analyze the ingredients of compound.［Results］We get the confirmed compound through nuclear magnetic resonance spectroscopy and mass spectrography.［Conclusion］The studies based on Glu-urea-Lys will offer the experimental and theoretical basis for the molecular iconography diagnosis and targeted therapies of prostate cancer.

Key words:PSMA;Glu-urea-Lys;prostate cancer

R34

A

1671-7295(2012)01-0013-05

国家自然科学基金项目(30670544)

2011-12-16;

2011-12-20

陈骁驰(1981-)，男，辽宁锦州人，博士研究生。

宋希双，教授。E-mail:song-xishuang@163.com