阿苯达唑及其代谢物在欧洲鳗鲡体内的药代动力学及残留研究

廖碧钗

(1.福建省淡水水产研究所 福建福州 350002;2.福建省水产技术推广总站)

1 前言

阿苯达唑(albendazole，ABZ)是一种广谱抗寄生虫药，作用强、毒性小，对许多动物如羊、猪、家禽等的胃肠道线虫、绦虫等有很好的疗效［1－3］，在水产养殖中主要用于鳗鲡蠕虫病的治疗［4，5］。ABZ进入体内以后，在肝微粒体药酶和还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的作用下，转化成阿苯达唑亚砜(a1bendazole sulphoxide，ABZSO)，是治疗囊虫病的有效成分，进而转化成砜(albendazole sulphone，ABZSO2)而失活，最终变成2－氨基砜排出体外［6］。ABZ及其代谢物在试验动物安全评价试验中表现出致畸和肝脏毒性［7］，因此成为动物性食品兽药残留的重要监控对象。国内外对ABZ及其代谢物在人、羊等动物体内的代谢动力学已有研究［8，9］，但在鳗鲡体内的药动及残留研究尚未见报道。本研究旨在了解ABZ及其代谢物在欧洲鳗鲡体内的分布及残留消除规律，为临床合理用药提供理论依据。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 实验动物

健康欧洲鳗鲡(Anguilla anguilla)，购自龙岩三华养鳗场，平均体重(100±10)g，试验前3 d停止喂食，水温控制(25±2)℃;经抽查试验用欧洲鳗鲡组织中均不含ABZ及其代谢物。

2.1.2 药品及试剂

ABZ标准品(含量99%)，购于德国DR.Ehrenstorfer公司;ABZSO标准品(含量99%)和ABZSO2标准品(含量98.5%)，购于德国Witega公司;ABZ原料药(含量89%)，购于陕西汉江制药有限公司;乙腈、甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

ABZ母液:准确称取ABZ原料药2 g，置于100 mL容量瓶中，加10 mL冰乙酸溶解，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为20 g/L的ABZ母液，4℃保存备用。

ABZ及其代谢物标准贮备液:分别准确称取ABZ、ABZSO和 ABZSO2标准品 10 mg，分别置于100 mL容量瓶中，用少许冰乙酸助溶，甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为100 mg/L的ABZ及其代谢物标准贮备液，4℃保存备用。

2.1.3 仪器

Agilent 1100高效液相色谱仪;XW－80A微型旋涡混合仪;飞鸽DL－5C离心机。

2.2 方法

2.2.1 色谱条件

色谱柱为SB－C18(4.6×150 mm，5 μm);流动相为乙腈:1%醋酸溶液，梯度洗脱程序见表1;检测波长为294 nm;进样量50μL;柱温25℃。

表1 梯度洗脱程序

2.2.2 给药方法及采样

试验用欧洲鳗鲡约300尾，随机等量分装至水族箱进行试验，每箱放曝气24 h以上的自来水150 L。给药时在每箱中各加15 mL ABZ母液，使水体终浓度为2 mg/L，浸浴36 h后彻底换水。给药后0.5、1、1.5、2、3、5、7、12、24、36、48、72、144、216、288、432、720、1440 和 2160 h 分别采集鱼样 10 尾，采血后用无污染的小刀割取背脊两侧肌肉，并迅速将皮剥离，依次放入标记好的样品袋中，每2尾为1组;样品置－20℃冷冻贮存，备用。

2.2.3 样品前处理

2.2.3.1 血浆样品的提取

取1.0 mL血浆，加1 mLNa2CO3溶液(2 mol/L)和6 mL二氯甲烷旋涡混合15 min，5000 r/min离心10 min，取上清液，置40℃水浴中氮气流吹干。用1.0 mL 45%乙腈水溶液溶解残留物，过0.45μm滤膜，定容至1.0 mL，HPLC 测定。

2.2.3.2 肌肉样品的提取

取2.0 g匀浆肌肉组织，加2 mL Na2CO3溶液(2 mol/L)和12 mL二氯甲烷旋涡混合15 min，5000 r/min离心10 min。取上清液，置40℃水浴中氮气流吹干。用2.0 mL 45%乙腈水溶液溶解残留物，旋涡混合2 min，超声波提取5 min。加入乙腈水饱和正己烷6 mL，旋涡混合1 min，5000 r/min离心2 min。弃去正己烷层，下层液经0.45μm微孔滤膜过滤，定容至1.0 mL，HPLC 测定。

2.2.4 标准曲线制备

于1.0 mL血浆和2.0 g匀浆肌肉样品中加入不同体积ABZ及其代谢物标准贮备液，制成含标准品浓度为 0.01、0.05、0.10、0.5、1.0、5.0 和 10.0 mg/L(kg)的样品溶液，按2.2.3的方法对样品处理后测定其峰面积，求出血浆和肌肉的标准工作曲线回归方程和相关系数。

2.2.5 回收率和精密度测定

取血浆和匀浆肌肉组织，加入ABZ及其代谢物标准贮备液适量，制成0.05、0.5 和 5.0 mg/L(kg)3个浓度的样品溶液。按2.2.3的方法处理，取50 μL进行HPLC测定，每个浓度重复测定5次，记录峰面积，计算其回收率。

将上述样品每个浓度日内测定5次，日间测5次，计算样品中药物浓度的日内、日间变异系数。

2.2.6 数据处理

采用PKS药代动力学软件进行模型拟合和参数计算;消除方程、休药期计算采用SPSS统计软件计算。

2.2.7 休药期计算

ABZ及其代谢物是按一级动力学过程从体内消除，即在消除后期服从指数消除:C=C0e－ket，根据消除后期测定的组织药物浓度及规定的最高残留限量(MRL)，计算各组织药物浓度降至规定水平所需的时间(WDT):

3 结果与分析

3.1 色谱行为及标准曲线

在2.2.1色谱条件下，各物质分离完全，峰形对称，保留时间稳定(图1)。在0.01－10 mg/L(kg)线性范围内，血浆和肌肉中ABZ及其代谢物的添加标准曲线见表2，其线性关系良好。

图1 ABZ及其代谢物在欧洲鳗鲡体内的色谱图

表2 ABZ及其代谢物在欧洲鳗鲡血浆和肌肉中的线性回归方程及相关系数

3.2 回收率和精密度

以信噪比(S/N)为3计算，本方法测定ABZ及其代谢物的最低检测限均为3μg/L，回收率均达74%以上，平均变异系数均低于6.71%，说明该方法回收率高、重复性好，详见表3。

表3 欧洲鳗鲡血浆和肌肉中ABZ及其代谢物的回收率和精密度

3.3 药代动力学

欧洲鳗鲡以2 mg/kg的剂量浸浴ABZ 36h后，ABZ的血药浓度在12 h达到最高值3.623 mg/L，144 h后不能检出;ABZSO的血药浓度在24 h达到最高值7.423 mg/L，1440 h后不能检出;ABZSO2的血药浓度在36 h达到最高值1.829 mg/L，432 h后不能检出。药物在血浆中的主要动力学参数如表4所示，经房室模型分析，ABZ和ABZSO的血药浓度时间数据符合一级吸收二室开放模型，ABZSO2的血药浓度时间数据符合一级吸收一室开放模型，其药 动 学 方 程 分 别 为:C = － 16.185e－0.160t+14.756e－0.098t+1.429e－0.020t、C= － 8.371e－0.184t+7.797e－0.009t+0.574e－0.007t和 C=7.925(e－0.015t－e－0.027t)，平均药时曲线见图 2。

表4 ABZ及其代谢物在欧洲鳗鲡血浆中的主要药动学参数

图2 ABZ及其代谢物在欧洲鳗鲡血浆中的药时曲线

3.4 药物消除规律

欧洲鳗鲡浸浴ABZ 12 h后，数据经SPSS统计处理得到血浆和肌肉组织中药物浓度(C)与时间(t)关系的消除曲线方程、相关指数(R2)及消除半衰期(T1/2)见表5，可知药物在血浆和肌肉中消除较缓慢。

表5 ABZ及其代谢物在欧洲鳗鲡血浆和肌肉组织中的消除曲线方程及参数

3.5 休药期

我国1999年发布的235号公告《动物性食品中兽药最高残留限量》中规定动物肌肉中ABZ的总残留量为100μg/kg，通过休药期公式计算可知肌肉组织中ABZ、ABZSO和ABZSO2的理论休药期分别为 7.34d、22.65d 和 13.98d。因此在本试验条件下，建议ABZ在欧洲鳗鲡体内的休药期为23d。

4 讨论

本试验比较了不同缓冲液和提取剂对血浆和肌肉中ABZ及其代谢物的回收率。在本试验条件下用磷酸盐缓冲液(pH7.4)和其他提取剂提取ABZ及其代谢物，ABZSO和ABZSO2的回收率都能达到80%左右，而ABZ的回收率很低(仅15%左右);当用Na2CO3溶液(2 mol/L)和其他提取剂提取时，ABZ及其代谢物的回收率均能达到70%以上;而用Na2CO3溶液(2 mol/L)和二氯甲烷作为提取剂，其回收率相对较高。说明在本试验条件下，ABZ更易在碱性较高的溶液中溶于二氯甲烷。

研究表明，ABZ在动物体内仅作为“前体性药物”，其原型药作用很小，主要作用是由它在机体内的代谢产物ABZSO来完成。ABZSO是ABZ发挥作用的活性物质［10，11］，2 － 氨基砜是 ABZ 的最终代谢物，无驱虫活性，仅在动物的尿中可发现［12］。因此本方法未将2－氨基砜列入残留检测对象。Averkin等比较了ABZ及ABZSO、ABZSO2代谢物的驱蠕虫活性，发现在鼠体内ABZSO比ABZ的驱虫活性要强，而ABZSO2几乎无驱虫作用［13］。本试验结果表明，浸浴给药后，ABZ在欧洲鳗鲡血浆中仅以少量存在，它在鳗鲡体内迅速、广泛地被代谢为ABZSO及少量的ABZSO2，这与其在人体与其他动物体内的检测结果相一致［14－18］。从药动学参数来看，浸浴ABZ后，ABZSO在血浆中的吸收速率常数较大，消除速率常数较小，AUC值大，说明ABZSO在鳗鲡体内能迅速吸收且消除缓慢，能发挥较好的驱虫作用。

农业部235号公告中限量规定的是ABZ及其代谢物的总残留量，在本试验条件下，ABZ和ABZSO2分别在给药后144h和432h就不能检出，因此，以ABZSO残留量代表总量作为该药在鳗鲡体内的休药期。但是，鱼体内的药物消除受许多因素影响，所以临床休药期要根据具体鱼种、实际养殖环境分别进行研究确定。

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