西红花酸体内外抗氧化作用的研究

石 磊

（安徽省金寨县中医院药剂科，安徽 六安 237300）

氧化应激是指机体活性氧（ROS）产生增加或清除减少，从而导致体内氧化还原自稳态失衡，ROS在体内大量蓄积而引起机体氧化损伤的过程。现代研究表明，ROS参与多种疾病的形成与发展，其中它所介导的低密度脂蛋白（LDL）氧化修饰是动脉粥样硬化（AS）发生、发展的关键环节[1]。氧化应激学说的提出为应用抗氧化剂防治AS提供了理论依据。番红花为鸢尾科植物番红花（Crocus sativus L.）的干燥柱头，在欧洲许多国家被广泛用作调味品和食品着色剂，有“香料之王”之美誉。现代研究表明，番红花具有抗氧化、抗凝血、抗肿瘤及免疫调节等多种药理作用，具有重要的临床应用价值。西红花酸为番红花中主要活性成分之一，具有明显的抗AS作用[2]，本研究主要从体内外两方面探讨西红花酸的抗氧化作用，以期阐明其抗AS作用机制，为临床使用西红花酸防治AS提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

Wistar大鼠，雌雄各半，体质量180～220g，由南京青龙山动物养殖场提供；西红花酸，由本实验室制备（含量＞80%）；总抗氧化能力（TAC）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）、丙二醛（MDA）及抗超氧阴离子（O2-）测定试剂盒由南京建成生物工程研究所提供；其他试剂均为分析纯。752紫外分光光度计，上海第三分析仪器厂；酶联免疫检测仪，Bio-Rad。

1.2 方法

1.2.1 超氧阴离子（O2-）清除能力测定利用次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应体系产生O2-，观察西红花酸对的清除作用。实验设对照组、维生素C组及西红花酸组（5、10、20μmol/L）。实验操作按试剂盒说明书进行。

1.2.2 LDL氧化易感性测定

取健康人静脉血，EDTA抗凝，分离血浆，超速离心法分离LDL，并于4℃在10 mmol/L PBS（pH 7.4）中透析24h，考马斯亮蓝法测定LDL中蛋白含量，并调整浓度至1mg/mL。实验设Control组、Model组（LDL＋Cu2+）、西红花酸组（LDL＋Cu2+＋西红花酸），每组6个样本。于96孔培养板中分别加入LDL和PBS（终反应体积0.2mL，LDL终浓度为100μg/mL），混匀。西红花酸组加入不同浓度西红花酸溶液（终浓度分别为5、10、20μmol/L），Control组和Model组均加入等量PBS，混匀，37℃孵育1h。除Control组加入PBS外，其余各组均加入CuSO4溶液（终浓度5μmol/L），37℃孵育3h，每10 min测定一次234 nm处吸光度（A234），参照文献方法[3]计算LDL氧化延迟时间（Lag time）和达最大氧化速率时间（Tmax）。将上述反应体系继续孵育至12h，加入EDTA-Na2终止反应，TBA比色法测定反应液中MDA含量。

1.2.3 大鼠血清抗氧化能力测定

Wistar大鼠18只，随机分为3组，即对照组和西红花酸组（50mg/kg及25mg/kg），每组6只，自由进食、饮水。西红花酸组每天灌胃给予相应浓度西红花酸，对照组给予等容量生理盐水，连续7d。末次给药后2h，眼眶取血，分离血清。血清TAC采用Fe3+还原法测定，血清SOD、GPX活性分别采用黄嘌呤氧化酶法和二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）比色法测定，操作按试剂盒说明书进行。另取血清0.2mL，加入50μmol/L CuSO4溶液0.2mL，混匀后于37℃孵育5 h，TBA比色法测定MDA含量。

表1 Inhibitory effect of crocetin on LDL oxidation induced by cupric ions （χ— ±s，n=6）

表2 Effect of crocetin on the susceptibility of rat serum to in vitro oxidation （χ— ±s，n=6）

1.2.4 统计学处理

2 结 果

2.1 西红花酸对O2-的清除作用

西红花酸呈浓度依赖性地减少次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应体系产生的，5、10和20μmol/L西红花酸对的清除率分别为23.59±5.49%、36.50±4.36%和53.40±7.62%。见图1。

图1 Scavenging effect of crocetin on superoxide anion （）generated by hypoxanthine/xanthine oxidase system （χ— ±s，n=6）..*P ＜0.01 versus Control.

2.2 西红花酸对LDL氧化易感性的影响

Lag time和Tmax是衡量LDL氧化易感性的两个重要指标。由表1可见，西红花酸能显著增加LDL氧化的Lag time和Tmax，这一结果与其减少铜离子诱导的MDA生成作用相一致，提示西红花酸能明显提高LDL抗氧化能力。

2.3 西红花酸对大鼠血清抗氧化能力的影响

由表2可见，大鼠在给予西红花酸7 d后，血清TAC及SOD、GPX活性均显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。正常情况下，大鼠血清MDA含量较低，补充西红花酸50 mg/kg和25 mg/kg虽有降低血清MDA趋势，但各组间并无明显差异（data not shown）；在加入铜离子氧化5 h后，对照组血清MDA含量显著增加，而在补充西红花酸的大鼠，其血清MDA含量明显低于对照组（P＜0.05或P＜0.01），提示西红花酸能显著提高大鼠血清抗氧化能力。

3 讨 论

ROS是生物体在需氧代谢或巨噬细胞呼吸爆发中产生的活性基团或分子，具有高度氧化活性，极易攻击生物膜中脂质及核酸、蛋白质等生物大分子，引起机体氧化损伤。现代研究表明，ROS参与多种疾病的病理进程，其中ROS介导的LDL氧化修饰，是AS形成与发展的关键环节。临床资料显示，AS患者血清及LDL抗氧化能力较正常人显著降低，血浆Ox-LDL水平明显升高且与AS病变程度密切相关[4,5]。抗氧化剂如维生素E、维生素C及β-胡萝卜素等的摄入量与AS性心血管病发病率呈负相关，补充多酚类、类胡萝卜素类等天然抗氧化剂能明显提高机体及LDL抗氧化能力，降低心血管疾病死亡率[6,7]。这些结果提示，补充抗氧化剂、增强机体及LDL抗氧化能力可能是防治AS及其相关性心脑血管疾病有效途径之一。

西红花酸为天然类胡萝卜素类化合物，能明显抑制AS形成与发展，但对其抗AS作用机制至今仍未完全阐明。本研究显示，西红花酸能有效清除次黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应体系产生的O2-，降低LDL氧化易感性，显示了良好的体外抗氧化活性。药动学研究表明，大鼠灌胃给予西红花酸50mg/kg，40 min后血药浓度即达峰值，10μmol/L以上血药浓度可维持100min以上[8]，这一浓度与本研究所用浓度接近，提示西红花酸在体内也能达到有效血药浓度，发挥清除ROS、抑制LDL氧化等作用。为了证实上述推测，本研究观察了西红花酸对大鼠抗氧化能力的影响。结果显示，西红花酸能明显提高大鼠血清TAC，后者是衡量机体抗氧化能力的重要指标。由于血清中脂质过氧化物主要存在于LDL等脂蛋白中，血清抗氧化能力与LDL氧化易感性密切相关，因此检测血清抗氧化能力可间接反映LDL氧化易感性。在本研究中，虽然补充西红花酸对大鼠血清脂质过氧化物MDA含量无明显影响，但却能显著增强血清抵抗铜离子诱导的氧化作用，提示西红花酸能有效提高血清抗氧化能力、降低LDL氧化易感性，这一作用与西红花酸提高AS家兔血清及LDL抗氧化能力、降低血清Ox-LDL水平相一致[2]，提示西红花酸可能通过提高机体抗氧化能力、减少LDL氧化修饰而发挥抗AS作用。

机体抗氧化防御体系主要包括SOD、GPX等抗氧化酶及维生素C、维生素E、β-胡萝卜素等ROS清除剂，提高这些酶的活性或增加抗氧化剂的摄入均可明显提高血清TAC，降低LDL氧化易感性及血清Ox-LDL水平，从而发挥抗AS作用[9]。本研究发现，西红花酸能明显提高大鼠血清SOD、GPX等抗氧化酶活性，这可能是西红花酸提高大鼠血清TAC的主要机制之一。此外，作为脂溶性类胡萝卜素类化合物，西红花酸可通过多种方式对ROS发挥直接清除作用。有研究表明，类胡萝卜素类化合物玉米黄质和β-胡萝卜素等可直接掺入细胞膜脂质双层或LDL等脂蛋白之中，当细胞或LDL等受到ROS攻击时，类胡萝卜素类首先被氧化，从而保护细胞或LDL等免受氧化损伤[10]。由于西红花酸也具有类似的化学结构，推测其也可能掺入细胞膜或LDL等脂蛋白之中而发挥抗氧化作用。

综上所述，西红花酸既能直接清除ROS，又能提高血清SOD、GPX等抗氧化酶活性，从而提高机体抗氧化能力，降低LDL氧化易感性，这可能是西红花酸抗AS作用主要机制之一，至于西红花酸提高SOD等抗氧化酶活性的确切机制仍有待于进一步研究。

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