超声辐照微泡对肝细胞生长因子转染大鼠损伤面神经的促进作用

郝亚宁，骆文龙

(重庆医科大学附属第二医院耳鼻咽喉头颈外科，重庆400010)

面神经作为一条重要的周围神经，主要功能是支配面部肌肉的运动。外伤、邻近组织感染、脑血管意外及医源性损伤都可能损伤面神经。近几年诸多学者对面神经损伤的修复进行了系统研究。由于基因治疗能在分子水平上纠正疾病的发病过程，因此在面神经损伤的防治上有较好的应用前景。肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)对感觉神经［1］、副交感［2］及交感神经［3－4］，特别是对运动神经［5－6］的发育、轴索生长都有一定的神经营养性作用和导向作用。超声辐照微泡能将目的基因转入各种靶细胞和靶组织，但它在面神经损伤修复的作用研究，尚未见国内外报道。因此本实验运用超声微泡介导HGF基因转染损伤后的面神经，观察HGF的表达及受损面神经传导速度、神经电位波幅、潜伏期等参数，探讨该方法的有效性，为面神经损伤的修复提供一种新型、高效、安全的方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物

清洁级SD大鼠，40只，雌雄不限，体质量200～250g，由重庆医科大学动物实验中心提供，合格证号:SCXK(渝)2007-0001。

1.2 质粒的提取

HGF菌液由重庆医科大学附属二院肝病研究治疗中心提供，HGF经大肠埃希氏菌扩增16 h后，按质粒大量抽提试剂盒 (Omega公司)说明提取。提取纯化的HGF经酶切电泳鉴定，紫外分光光度计测定其浓度为1 g/L。

1.3 试剂

Trizol试剂，兔抗鼠HGF多克隆抗体和兔抗鼠β-actin多克隆抗体，羊抗兔IgG，化学发光试剂，(武汉谷歌生物科技有限公司);脂质微泡，(重医附二院超声影像学研究所提供)白色冻干粉末状。使用时将2 mL 0.9%氯化钠注射液注入瓶中，振荡混匀，微泡浓度为(0.5～1)×108个/mL，微泡直径为3 ～5 μm。

1.4 动物模型的制作

5%戊巴比妥(30 mg/kg)腹腔内注射麻醉大鼠并仰卧位固定，再以5%利多卡因局部追加麻醉。在手术显微镜下切开右侧颞骨骨泡，用钻磨开镫骨肌支面神经骨管3 mm左右，蚊式钳钳夹面神经干长约2 mm，力量为三扣，持续60 s，松开30 s，再钳夹60 s，手术显微镜观察面神经损伤程度为束膜性神经中断，符合 Sunderland损伤Ⅳ度［7］.

1.5 脂质微泡与HGF基因的结合

用一次性注射器取2 mL 0.9%氯化钠注射液，注入微泡冻干粉瓶中，充分摇匀;取含HGF基因溶液0.5 mL(质粒浓度为1 g/L)，加入微泡瓶中，摇匀后室温下静置30 min，使之充分黏附在微泡表面，该混合液中质粒浓度为0.2 g/L。

1.6 动物分组及给药

模型制作成功后，将大鼠随机分成4组，A组:单纯手术组(PBS);B组:HGF+微泡组;C组:HGF+超声组;D组:HGF+超声+微泡组，每组10只。D组经股静脉注入载基因微泡溶液1 mL(含0.2 mg HGF)，再用超声转染仪，频率1 MHz，功率0.75 W/cm2，紧贴面神经受损部位进行体外照射，照射10 s，间隔10 s，共2 min;C组经股静脉插管注入1 mL含0.2 mg HGF溶液，同样采用上述超声参数，B组经股静脉输入同等剂量的载基因微泡，不用超声触发;A组输入1 mL PBS作为对照。

1.7 标本采集

基因转染后28 d，再以3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉。打开胸腔后，经左心室向升主动脉插管，剪开右心耳。迅速灌注0.9%NaCI约300 mL至从右心耳流出的血液完全变清，再灌注4%多聚甲醛约250 mL，先快后慢，致动物四肢僵硬。切取吻合处神经组织1 cm×1 cm，用于Western blot和RT-PCR检测。

1.8 神经电生理学检测

采用BL-6420C生物信号采集与处理系统，将自制的针灸针电极作为刺激电极，两极间的距离约为9 mm。记录电极为针灸针(经氯化银镀银处理)双极记录电极。基因转染后28 d检测:常规10%水合氯醛麻醉大鼠后固定，将针灸针刺激电极分别插至神经干术后处的中枢端和外周端的肌肉，尽量将刺激电极靠近神经，再将记录电极插进受面神经支配的面颊肌，插入深度约为3～5 mm，两电极间距离约为4～6 mm。刺激方式为正方波刺激(频率60 Hz、波宽1 ms)，刺激电流从0 mA开始，至出现动作电位。测定面神经传导速度(nerve conduction velocity，NCV)、潜伏期(Latency)及动作电位的波幅(Amplitude)。

1.9 大鼠吻合处神经组织中HGF基因mRNA转录的检测

采用RT-PCR法，根据GenBank中登录的HGF(NM 017017)基因设计引物，正向序列:5'-GCTACA CAGGGAATCCTCTCG-3'，反向序列:5'-CGTTTCTCC TCGCCTCTCTC-3'，扩增片段大小334 bp;内参β-actin(NM 031144)正向序列:5'-CGTTGACATCCG TAAAGACCTC-3'，反向序列:5'-TAGGAGCCAGGG CAGTAATCT-3'，扩增片段大小110 bp，引物由武汉谷歌生物科技有限公司合成。用Trizol试剂提取吻合处神经组织RNA，合成cDNA第一链，再以其为模板，进行 PCR扩增，反应条件:94℃ 30 s，54℃，30 s，72℃ 40s，35个循环。mRNA水平用β-actin作为内标，以扩增倍数=2－△△CT表示基因相对表达量。

1.1 0 大鼠吻合处神经组织中HGF蛋白表达的检测

采用Western blot法，按100 mg组织:1 mL细胞裂解液的比例，4℃冰浴匀浆，提取总蛋白。用核酸蛋白定量仪进行蛋白定量。取40 μg蛋白，经12%SDS-PAGE分离，转移至硝酸纤维膜上，用封闭液(5%的脱脂奶粉)室温封闭2 h;加入兔抗鼠HGF多克隆抗体和兔抗鼠 β-actin多克隆抗体(1∶200稀释)，37℃孵育2 h;PBST洗膜，加入羊抗兔 IgG(1∶400稀释)，37℃孵育2 h;化学发光试剂反应约2 min，发光成像仪呈像并测定条带吸光度值。以目的条带和内参条带吸光度值的比值作为目的蛋白相对表达量。

1.1 1 统计学分析

各实验组做10个样本，实验重复3次。数据以均数±标准差(±s)表示，通过 SPSS18.0软件，采用多个样本均数间两两比较的q检验。

2 结果

2.1 各组大鼠的一般情况

各组大鼠基因转染后无一例死亡，手术切口一期愈合。术后1 d，各组动物均有饮食下降、精神萎靡，右侧面神经受损后，胡须集中伸直，不能摆动，鼻尖偏向左侧，表现为完全性面瘫。伤后10 d，各组大鼠情况没有明显好转。伤后20 d，A、B、C组情况没有显著改变。D组大鼠右侧胡须仍集中倒状，但少量胡须有细微的摆动，鼻尖仍向左偏斜。伤后28 d，A、B、C组大鼠虽然有明显的改变，但没有完全恢复。D组大鼠右侧胡须大部分向前竖起，可见节律性摆动，鼻尖居正中，大鼠右眼可以闭合。局部皮肤红肿消退，感觉障碍，肌肉萎缩也较其余3组轻。

2.2 神经电生理检测

D组面神经传导速度、神经电位波幅明显高于其余3组，潜伏期明显低于其余3组(P＜0.05)。C组面神经传导速度、神经电位波幅明显高于A、B两组(表1)

表1 28 d后各组大鼠面神经传导指标比较Table 1 Comparison of facial nerve conduction indices among 4 groups 28 day after(x ± s，n=10)

2.3 各组大鼠吻合处神经组织中HGF基因mRNA的转录水平

D组损伤面神经中HGF mRNA表达量明显高于A、B、C组(P＜0.05)。C组损伤面神经中HGF mRNA表达量明显高于A、B组(P＜0.05)(图1)。

图1 RT-PCR检测大鼠HGF mRNA的表达Fig 1 HGF mRNA expression in rat was detected by real-time RT-PCR(x ± s，n=10)

2.4 各组大鼠吻合处神经组织中HGF蛋白的表达水平

D组损伤面神经中HGF蛋白表达量明显高于A、B、C组(P＜0.05)。C组损伤面神经中HGF蛋白表达量明显高于A、B组(P＜0.05)(图2，3)。

3 讨论

基因治疗主要目的是纠正基因水平上蛋白质异常表达，通过基因治疗方式导入神经生长因子的目的基因，使已降低的神经生长因子恢复到正常水平［8］。目前将外源基因转染靶细胞的载体主要有病毒载体与非病毒载体。病毒载体效率高，但细胞毒性高、免疫原性强;非病毒类载体较安全，但效率低［9］。因此选择一个合理、安全及高效的给药方式尤为重要。

本研究以HGF作为治疗基因，采用超声靶向破坏微泡技术将HGF转染入受损面神经周围。微泡造影剂已被证明是一种新型、安全及高效的基因载体。当微泡造影剂被注射到静脉后，微泡造影剂会到达受损面神经局部。此时在靶区给予一定强度和频率的超声辐照，受损面神经周围的微泡会破裂，从而释放出HGF基因并通过细胞膜产生的小孔进入细胞，达到转染目的。从结果可以得出，D组大鼠无论是触须摆动、鼻尖位置还是能否完全闭眼均明显优于其他3组。D组大鼠面神经传导速度、诱发电位波幅以及潜伏期明显优于其他3组，D组HGF蛋白及mRNA的表达量也显著高于A、B、C组，说明脂质微泡能有效的与目的基因相结合，在一定频率及强度超声的作用下，能将目的基因转染入受损的面神经，为建立修复损伤面神经的微环境提供安全有效的保障。此外，C组与A、B两组之间统计学意义也有显著差异，说明C组也可以将HGF转染入受损面神经周围，这是因为超声自身具有的机械效应和热效应能将HGF基因转染入靶细胞或靶组织，只是相比D组的转染效率要弱。这是因为载基因微泡在一定频率和强度超声作用下破裂，产生的空化效应所致。

综上所述，本实验表明超声微泡可以提高基因的转染效率，从而验证了超声微泡介导HGF转染的潜在应用价值，它能够作为一种有效的非病毒基因转染载体，为面神经损伤的基因治疗提供实验依据。

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