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NF-κB和AP-1在胶原性关节炎小鼠滑膜组织中的表达及活性升高

2012-09-15罗心静莫选荣周玲玲

基础医学与临床 2012年11期
关键词:滑膜孵育活化

罗心静,莫选荣,周玲玲

(台州学院医学院生理学教研室,浙江台州318000)

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以累及周围关节为主要表现的系统性自身免疫病。炎性细胞因子过度表达是导致RA滑膜炎症和骨质破坏的重要因素。而在炎性介质的表达调节中,核转录因子Kappa B(nuclear factor κB,NF-κB)和激活蛋白 1(activator protein-1,AP-1)被认为是最重要的转录调控分子,它们的表达和活性增加可促进炎性细胞因子的生成[1-2]。本研究观察了胶原性关节炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠滑膜中 NF-κB 和 AP-1表达及活性变化,以探讨RA病变的机制。

1 材料与方法

1.1 动物:清洁级雄性DBA/1小鼠20只,年龄8~10周(上海实验动物中心),正常饲养。

1.2 试剂:牛II型胶原(Chondrex公司);完全福氏佐剂(CFA)或不完全福氏佐剂(FIA)(Sigma公司);TNF-α和IL-6酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(博士德公司);抗AP-1(fos)抗体和抗NF-κB(P65)抗体(Cell signal公司);电泳迁移率分析(EMSA)试剂盒(Pierce公司);AP-1寡核苷酸探针(5'-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3')、NF-κB 寡核苷酸探针(5'-AGTTGA GGGGACTTTCCCAGGC-3')由上海英俊公司合成。

1.3 分组和造模:将小鼠随机分成正常对照组和CIA模型实验组。CIA模型制备参照文献[3]。初次免疫30 d后处死小鼠,心脏取血,分离血清,并取左后足跖趾关节连续冰冻切片。

1.4 细胞因子检测:小鼠血清中 TNF-α、IL-6的含量用ELISA法检测,具体操作按ELISA试剂盒说明书进行。

1.5 免疫组化法检测NF-κB和AP-1表达:石蜡切片脱蜡水化;蒸馏水冲洗后于3%H2O2孵育10 min,PBS洗后微波法修复抗原,滴加封闭血清,室温孵育20 min;滴加适当稀释抗NF-KB(P65)或抗AP-1(fos)抗体,37℃孵育2 h;PBS冲洗后滴加生物素标记的二抗,37℃孵育15 min;PBS冲洗后滴加辣根酶标记的链霉卵白素工作液,37℃孵育15 min;PBS冲洗后滴加DBA显色。冲洗后苏木素复染,中性树胶封片。图片分析仪进行图片分析,测定平均吸光度值。

1.6 EMSA检测NF-κB和AP-1的活性:分离滑膜组织核蛋白,按Pierce公司试剂盒说明书检测NF-κB和AP-1的DNA结合活性。

1.7 统计学分析:采用SPSS 13.0软件包处理,实验结果以均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验分析。

2 结果

2.1 血清中TNF-α和IL-6表达水平的检测:CIA小鼠血清中TNF-α和IL-6水平明显高于对照组[(750.5±45.6)ng/L vs(203.6±32.3)ng/L和(93.1±8.8)ng/L vs(26.8±5.2)ng/L](P <0.05)。

2.2 滑膜组织中AP-1和NF-κB表达的检测:CIA小鼠关节滑膜中NF-κB阳性染色程度明显强于正常对照组(P<0.05);AP-1阳性染色程度也明显强于正常对照组(P<0.05);阳性细胞分布于滑膜衬里层,胞质及胞核内均有染色,但胞核染色较深(图1,表1)。

表1 CIA小鼠和正常对照小鼠NF-κB(P65)和AP-1(c-fos)的表达Table 1 The expression of NF-κB(P65)and AP-1(c-fos)in control and CIA mice(x ± s,n=10)

2.3 滑膜组织中AP-1和NF-κB的活性检测:CIA小鼠关节滑膜中 NF-КB DNA结合活性明显高于正常对照组,AP-1 DNA结合活性也显著高于正常对照组(图2)。

图1 CIA小鼠和正常对照小鼠NF-κB(P65)和AP-1(c-fos)的表达Fig 1 The expression of NF-κB(P65)and AP-1(c-fos)in control and CIA mice(SP,×400)

图2 CIA小鼠和正常对照小鼠NF-κB(P65)和AP-1(c-fos)的DNA结合活性Fig 2 The DNA binding activity of NF-κB(P65)and AP-1(c-fos)in control and CIA mice

3 讨论

炎性细胞因子在RA发病机制中起了重要作用,是使RA病变持续存在、迁延进展的关键因素。在RA的关节滑膜及关节液中,多种炎性细胞因子的表达显著增高,如TNF-α、IL-1和IL-6等,这些炎性细胞因子的异常表达可导致滑膜炎性反应和骨质破坏。尽管导致这些炎性细胞因子表达增加的机制目前尚未完全清楚,但核转录因子NF-κB和AP-1在炎性细胞因子表达中的作用已受到学者广泛的关注。

NF-κB是核转录因子,有文献报道在RA滑膜组织中NF-κB异常高表达,而且滑膜细胞遭受炎性因子刺激时NF-κB被活化[1]。本实验研究证实,CIA 小鼠滑膜中 NF-κB蛋白表达显著增加,NF-κB蛋白阳性细胞主要位于滑膜衬里细胞层,并且胞核染色明显强于胞质染色,同时CIA小鼠滑膜中NF-κB的DNA结合活性明显增强。提示在RA滑膜中,NF-κB在某些因素刺激下表达和活性增强,进而使炎性细胞因子过度表达,导致滑膜炎性反应和骨质破坏。

AP-1是炎性细胞因子刺激所活化的另一重要核转录因子[2]。为了探讨AP-1在RA病变中的作用,本研究采用免疫组织化学法和EMSA法对CIA小鼠滑膜中AP-1的表达和活化进行检测。结果发现CIA小鼠关节滑膜中AP-1蛋白表达增加,并且AP-1 DNA结合活性增强。AP-1的表达增加和活性增强可能与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路活化有关。活化的MAPK(包括P38、ERK、JNK等)可使 AP-1磷酸化而活性增强,促进炎性细胞因子的产生。

[1]Muller-Ladner U,Gay RE,Gay S.Role of nuclear factor kappaB in synovial inflammation[J].Curr Rheumatol Rep,2002,4:201-207.

[2] Peng SL.Transcription factors in autoimmune diseases[J].Front Biosci,2008,13:4218 -4240.

[3]Luo X,Zuo X,Mo X,et al.Treatment with recombinant Hsp72 suppresses collagen-induced arthritis in mice[J].Inflammation,2011,34:432 -439.

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