高效液相色谱法和化学发光酶免疫法测定万古霉素的血药浓度

2012-09-14王维忠钱南萍

中国药业 2012年20期

王维忠，钱南萍，陈斌，马莹

(江苏省泰州市人民医院，江苏泰州 225300)

万古霉素是一种糖肽类抗生素，对革兰阳性菌有较强的杀菌作用，尤其适用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的感染[1]。万古霉素耳毒性的发生与血药浓度过高有关，当血药浓度持续数天超过80 mg/L时，即会损伤听力[2]。虽然现在万古霉素剂量与血药浓度的线性关系已经明确，临床中并不需要常规进行治疗药物临床监测，但长疗程患者、剂量过大、服用药物过多和肾功能不全者、老年患者等更易发生耳毒性，万古霉素治疗范围较窄，因而根据患者的临床实际情况实施个体化用药就显得尤其重要。治疗药物监测被认为是减少万古霉素不良反应的工具之一，目前国内外对万古霉素的血药浓度监测已采用了免疫检测法、微生物法、高效液相色谱法[3－6]等。笔者参照有关文献，用高效液相色谱(HPLC)法和化学发光酶免疫(CLEIA)法测定万古霉素血药浓度，并对两种方法的测定结果利用 t检验进行比较，评价两种方法的差异。

1 仪器与试药

HPLC系统，包括1525泵，2487型紫外可见光检测器，Empower色谱工作站(美国Waters公司);80－2型离心机(上海手术机械厂);TGL－16C型离心机(上海安亭科学仪器厂制造);AXSYM高效能全自动免疫分析仪等。万古霉素标准品(日本ELi LiLLy公司，批号为 H20030375，纯度 99.2%);乙腈(Canada，ACETONITRILE－190)为色谱纯;硫酸锌、磷酸二氢钾为分析纯;空白血浆(泰州市中心血站提供);万古霉素试剂盒(雅培公司)VancomycinⅡReagent Pack(Rgnt Lot:79083Q103)。

2 方法与结果

2.1 血清样品采集

30例临床应用万古霉素的成年患者(万古霉素1.0 g+5%葡萄糖250 mL恒速静脉滴注，100～120 min内滴注完毕，每日2次，连用3 d)，静脉滴注结束后30～60 min取前臂静脉血3 mL离心后的血清测定峰浓度，取下一次静脉滴注万古霉素前30 min离心后的血清测定谷浓度。

2.2 高效液相色谱法测定血药浓度

2.2.1 色谱条件

色谱柱:Hypersil BDS C18柱(150 mm ×4.6 mm，5.0 μm);流动相:磷酸二氢钾(0.05 mmol/L)－乙腈(8∶92);流速:1 mL/min;检测波长:236 nm;进样量:20 μL。万古霉素的检测波长，有文献报道采用236 nm和280 nm[7－8]，本试验发现该药的吸光度在236nm波长处远大于280nm波长处，故采用236nm作为检测波长。

2.2.2 血液样品处理

取血浆样品 400 μL，置 1.5 mL离心管中，加入配制好的10%硫酸锌溶液50 μL作为沉淀剂沉淀血浆，离心(4 000 r/min)后取20 μL进样，测定万古霉素的峰高[5]。万古霉素的血样提取方法，有文献报道采用乙腈－异丙醇(1∶1)沉淀血浆后，氯仿或二氯甲烷萃取上清液的方法进行血样提取[3]，但此操作较烦琐，且沉淀剂用量较大，血样检测灵敏度降低;本试验采用文献报道的以10%硫酸锌为沉淀剂，采用一次沉淀法，提取操作简单，沉淀较完全，且采血少(400 μL)，沉淀剂用量少(仅 50 μL)，加沉淀剂后血浓度稀释不到20%，从而大大提高了血样的检测灵敏度，由于无需有机溶剂提取，提取过程中的误差相对较少[5]。

2.2.3 系统适用性试验

按2.2.1项下色谱条件进样。结果表明，血浆对万古霉素的测定无干扰，万古霉素的保留时间为6.3 min，空白血浆、空白血浆+对照品、用药后血浆样品的色谱图见图1。

图1 万古霉素高效液相色谱图

2.2.4 标准溶液配制

精密称取万古霉素标准品适量，精密称定，以注射用水配成质量浓度为200 μg/mL的贮备液，再以空白血浆稀释成5，10，20，40，60，80 μg/mL 的血浆标准溶液。

2.2.5 方法学考察

线性关系考察:取万古霉素系列质量浓度的标准溶液，按血浆样品处理后，取20 μL进样，以峰高(A)对药物质量浓度(C)作线性回归，得线性回归方程 A=127.37 C+228.93，r=0.999 3(n=5)。结果表明，万古霉素在 5.0 ～80.0 μg/mL 质量浓度范围内与峰高呈良好线性关系。

精密度试验:取质量浓度分别为10，20，40 μg/mL的万古霉素血浆标准溶液，1 d内重复测定5次，连续测定5 d，计算3种质量浓度日内 RSD和日间 RSD。结果见表1。

回收率试验:取3种质量浓度的万古霉素标准液，由标准曲线测得的各质量浓度与实际质量浓度比较，得回收率。结果见表2。

稳定性试验:取10，20，40 μg/mL的万古霉素血浆标准溶液各2份，其中1份室温下保存，另1份于－20℃冷冻保存，分别于0，2，4，8，12 h时取样测定万古霉素的质量浓度。结果表明，万古霉素血浆样本在室温和冻融条件下测定时不需要特殊保护处理，稳定性良好。

2.3 CLEIA法测定血药浓度

取质量浓度为 0，5，10，25，50，100 μg/mL 的万古霉素标准品，以万古霉素试剂盒检测，得到相应的标准曲线，运行后仪器进行自动测试和标准曲线的拟合，贮存在仪器中。精密度试验结果、回收率试验结果见表1和表2。

2.4 测定结果比较

30例患者血样，用药前后同一血样分别采用HPLC法和CLEIA法测定血药浓度，以CLEIA法测得的质量浓度为 X，以HPLC法测得质量浓度为 Y，得回归方程为 Y=0.9821X+0.1760。结果，两法测定值相关性良好(r=0.987 1)，见图2。用配对 t检验两种方法是否存在差异，结果差异无统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

高效液相色谱法测定万古霉素血药浓度准确、灵敏度高，按照色谱条件操作后，出峰比较理想，色谱分离比较完全，精密度和回收率都比较好，但其操作需要专门的仪器及耗材，对试验者的要求也较高，需要避免流动相、沉淀剂等对血清样品的干扰，操作复杂，试验时间较长。化学发光酶免疫分析法是一种有效的微量和痕量分析法，用化学发光剂直接标记抗原或抗体，根据化学发光体系中的光子发光强度的大小，测定微量的抗原或抗体;AXSYM高效能全自动免疫分析仪在检测过程中采用全自动精确的加样系统、恒温系统、试剂冷藏系统、超声波清洗系统、磁场分离系统和中心数据处理系统等，能减少试验误差，提高检测速度。化学发光酶免疫法可同时大量地对同种药物的血药浓度进行监测，节约时间，提高医院工作效率，但需要专门的试剂盒，检测成本较高。本试验结果显示，两种方法无显著性差异，虽然各有优缺点，但两者具有较好的相关性，测定结果并不需要相互校正，在临床治疗药物临测工作中可以根据监测要求和监测目的灵活运用。