高效液相色谱法与化学发光酶免疫分析法测定丙戊酸血药浓度的比较

范 毅，钱南萍，陈 斌

(江苏省泰州市人民医院，江苏 泰州 225300)

丙戊酸是一种广谱抗癫痫药，可作为癫痫小发作、大发作和肌阵挛的首选药物之一，有效血药浓度为50～100 μg/mL，由于治疗窗窄、个体差异大、不良反应和血药浓度相关，中毒症状与癫痫发作症状难以判断。为最大限度地发挥疗效和避免不良反应，及时监测其血药浓度[1]，根据患者的实际临床情况实施个体化用药尤为重要。笔者采用高效液相色谱法[2－5]与化学发光酶免疫分析法[6－7]分别测定丙戊酸血药浓度，比较二者的监测结果，分析其相关性[8－11]，为临床合理用药提供依据。

1 仪器与试药

高效液相色谱系统(美国Waters公司)，包括2487型双通道紫外检测器、1525型二元泵、Empower色谱工作站;80－2型离心机(上海安亭科学仪器厂);YW－2型吹气式浓缩干燥器(南京和谐色谱配件研究所);DKZ－2型电热恒温振荡水槽(上海精宏实验设备有限公司);GM－0.33隔膜真空泵(天津市腾达过滤器件厂);XW－80A漩涡混合器;AXSYM化学发光酶免疫分析仪(美国雅培公司)等。丙戊酸对照品(美国 Sigma公司，批号47H3481);内标环己烷羧酸(CHCA，美国Aldrich Chem公司);衍生化试剂:2－溴－对硝基苯乙酮 (比利时Acros Organics公司);甲醇、三乙胺、乙腈、正己烷均为色谱纯，其他试剂为分析纯;化学发光酶免疫法丙戊酸检测试剂由美国雅培公司提供。

2 方法与结果

2.1 样品采集

46例确诊为癫痫的门诊和住院患者，男26例、女20例，服用丙戊酸达稳态后(10～14 d)，于末次服药的次日晨服药前采静脉血3 mL，以2 500 r/min的速度离心5 min，取血清置4℃冷藏备用。

2.2 高效液相色谱法(HPLC)测定

2.2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Hypersil BDS C18柱(150 mm ×4.6 mm，5 μm);流动相:甲醇 －水 (80∶20);流速:1.0 mL/min;检测波长:265 nm;柱温:室温;进样量:10 μL。在此条件下，色谱图见图1。丙戊酸的保留时间为4.8 min，峰形良好，血浆对丙戊酸的测定无干扰。

图1 高效液相色谱图

2.2.2 溶液制备

丙戊酸对照品溶液:准确称取丙戊酸对照品50 mg，置10 mL容量瓶中，加0.2 mol/L氨水稀释至刻度，摇匀，即得5 000 μg/mL的对照品溶液。内标液:准确称取环己烷羧酸(CHCA)，以正己烷配制成质量浓度为4.8 μg/mL的内标溶液。衍生化试剂:以乙腈溶解 2－溴－对硝基苯乙酮，配制成5.0 g/L的溶液，避光保存。三乙胺应用液:用乙腈稀释三乙胺，配制成0.2%的溶液。

2.2.3 血清样品处理

取血清样品 250 μL，加 1 mol/L硫酸 250 μL，加 CHCA 提取液 1 mL，混匀振荡 0.5 min，离心 8 min(3 500 r/min)，取上层提取液 600 μL，吹干后加三乙胺应用液 100 μL、衍生化试剂 50 μL，振荡混匀，45℃水浴15 min，吹干后用100 μL流动相溶解，取10 μL 进样。

2.2.4 方法学考察

标准曲线绘制:精密取丙戊酸对照品溶液适量，加健康人的空白血清分别稀释成 10，20，40，80，120，180 μg/mL 的丙戊酸系列标准溶液，按2.2.3项下方法处理后进样测定，并以质量浓度(X)对丙戊酸和内标的峰高(Y)比作线性回归，得回归方程 Y=0.003 8 X －0.015 1，r=0.998 9(n=6)。结果表明，丙戊酸质量浓度在10～180 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。

精密度和回收率试验:准确配制40，80，180 μg/mL 3种质量浓度的丙戊酸血清样本各5份，按2.2.3项下方法处理后，并于日内及隔日进行测定，计算日内、日间精密度及方法回收率。结果见表1。

表1 HPLC法精密度及回收率试验结果(±s，n=5)

表1 HPLC法精密度及回收率试验结果(±s，n=5)

理论浓度(μg/mL)精密度试验(%) 回收率试验40 80 180日内RSD 4.35 1.78 4.17日间RSD 4.71 3.23 4.65测定浓度(μg/mL)41.35±0.61 78.56±2.84 183.71±1.01回收率(%)103.38 98.20 102.06

稳定性试验:取正常人血清配制浓度为80 μg/mL的丙戊酸血清样本各3组(2管/组)，第1组室温放置，第2组于－18℃冷冻放置15 d，第3组于－18℃冷冻存1个月，分别于0，6，12 h时取样，按2.2.3项下方法操作进行测定比较。结果显示，血清样品中丙戊酸的含量在室温和反复冻融条件下未发生明显变化。

2.3 化学发光酶免疫分析法(CLEIA)测定

2.3.1 测定方法

采用微粒子固相免疫竞争法，借助化学发光基质产生光子，然后根据化学发光体系中的光子发光强度的大小，测定微量的抗原或抗体。

2.3.2 方法学考察

标准曲线制备:取丙戊酸标准曲线盒中 0，12.5，25，50，100，150 μg/mL的丙戊酸标准品，加入AXSYM分析仪器的样品杯中，按仪器操作指南操作检测结果，仪器自动生成1条标准曲线存储于程序中，得回归方程为 Y=6.944 9 X－7.502 3，r=0.999 2(n=6)。

精密度和回收率试验:选择高、中、低3种质量浓度的丙戊酸标准样本各5份，按CLEIA方法操作处理，并于日内及隔日进行测定，计算日内、日间精密度及方法回收率。结果见表2。

表2 CLEIA法精密度及回收率试验结果(±s，n=5)

表2 CLEIA法精密度及回收率试验结果(±s，n=5)

理论浓度(μg/mL)精密度试验(%) 回收率试验20 80 150日内RSD 1.17 2.31 2.53日间RSD 3.06 3.91 4.19测定浓度(μg/mL)19.86 ±0.78 82.33 ±1.25 151.75 ±2.42回收率(%)99.30 102.91 101.17

2.4 两种方法相关性评价

用HPLC法和CLEIA法平行测定46例患者丙戊酸血药浓度，以HPLC法测得的浓度(X)对CLEIA法测得的浓度(Y)作线性回归，得回归方程为 Y=0.980 2 X+2.477 7(r=0.979 3)，回归曲线见图2。结果表明，两种方法测得的结果显示出良好的相关性。将丙戊酸样品的HPLC法测定结果和CLEIA法测定结果进行配对 t检验，两种方法的测定结果在统计学上差异无显著性(P ＞0.05)。

图2 两种方法相关性回归曲线图

3 讨论

丙戊酸可以单独使用或与其他抗惊厥类药品联用，用于对失神发作的治疗，由于能够达到治疗多种类型发作的目的得以广泛使用。根据我院的试验条件，可以用HPLC法和CLEIA法测定丙戊酸血药浓度，HPLC法准确、特异性好、灵敏度高，其缺点是测定周期长，技术要求高，适用于试验要求较高的药动学的研究;CLEIA法试剂无毒、无污染、安全稳定、样品用量少，用时短，适用于临床急救及大批生物样品的常规血药浓度监测，大大提高了医院的工作效率，其缺点是仪器与试剂盒价格昂贵、依赖进口。本研究结果表明，HPLC法和CLEIA法测定丙戊酸血药浓度结果无需相互校正，在实际临床治疗药物监测中可互相替代。

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