消癌平注射液高效液相色谱指纹图谱的建立

付晓秀，周国威，齐永秀

(1.山东省聊城市第二人民医院，山东 聊城 252600;2.泰山医学院，山东 泰安 271000)

1 仪器与试药

Waters 600型高效液相色谱仪(美国Waters公司);Empower色谱工作站(美国Waters公司);KQ－500E型医用超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。绿原酸对照品(批号为110753－200413，中国药品生物制品检定所);消癌平注射液(通化神源药业有限公司);甲醇为色谱纯(TEDIA);磷酸(H3PO4)、磷酸二氢钾为分析纯;蒸馏水(试验室自制双蒸水)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱:Diamonsil® C18柱(250 mm × 4.6 mm，5 μm);流动相:A(甲醇)∶B(磷酸－磷酸二氢钾)，梯度洗脱(表 1);流速:1.0 mL/min;检测波长:327 nm，柱温:室温;进样量:20 μL。在上述色谱条件下，消癌平注射液的9个色谱峰均得到良好分离。高效液相色谱图见图1。

2.2 溶液制备

精密称取绿原酸对照品适量，加甲醇溶解并定容，得绿原酸对照品溶液(200 μg/mL);精密移取消癌平注射液1 mL于10 mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。

2.3 方法学考察

精密度试验:精密吸取同一批供试品溶液20 μL，按拟订色谱条件连续进样6次，记录色谱图。以绿原酸色谱峰(3号峰)为参照，计算10批供试溶液各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果的 RSD均小于3%，精密度良好，符合指纹图谱的检测要求。

表1 梯度洗脱程序

图1 高效液相色谱图

重复性试验:取同一批消癌平注射液，按2.1项下方法制备供试品溶液6份，并各吸取20 μL，按拟订色谱条件分别测定，记录色谱图。以绿原酸色谱峰(3号峰)为参照，计算10批供品试溶液各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果的 RSD与相对峰面积 RSD均小于3%，说明方法重复性良好，符合指纹图谱的检测要求。

稳定性试验:精密吸取同一批消癌平供试品溶液20 μL，按拟订色谱条件测定，分别记录 0，1，3，7，12，24 h 时的色谱图。以绿原酸色谱峰(3号峰)为参照，计算10批消癌平供试品溶液各共有峰的相对保留时间和相对峰面积。结果的 RSD均小于3%，消癌平供试品溶液在24 h内基本稳定。

2.4 高效液相指纹图谱的构建

共有指纹峰的标定:取10批消癌平注射液，分别按2.1项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件进行指纹图谱测定，同时在该色谱条件下对绿原酸对照品溶液进样分析。结果见图2，其中3号色谱峰鉴定为绿原酸。

图2 绿原酸和10批消癌平注射液的指纹图谱

指纹图谱相似度评价:将试验数据导入国家药典委员会编写的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A版”。参数设置为1)指纹图谱积分参数，峰宽0.5，最小峰面积0.3，最小峰高1;2)参照谱图，采用其中一批样品指纹图谱为参照谱图;3)时间窗宽度，0.30;4)数据剪切，0～5 min内为非保留组分色谱峰和溶剂峰，为避免对相似度值的影响，供试品指纹图谱中0～5 min内的色谱峰予以剪切，得到消癌平特征图谱的共有模式图(图3)。计算10批消癌平注射液特征图谱的相似度(见表2)。从表中数据可以看出，各批样品的相似度均大于0.9，相似度良好。

图3 消癌平注射液指纹图谱的共有模式图

表2 10批消癌平注射液特征图谱的相似度

共有峰相对保留时间、相对峰面积:3号峰为绿原酸峰，峰面积稳定，分离度良好，将其作为参照峰。以绿原酸峰(3号峰)的保留时间和色谱峰面积为1，计算各特征峰的相对保留时间(表3)和相对峰面积(表4)。10批消癌平注射液中各共有峰的相对保留时间和相对峰面积均小于2%，符合《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求》中的有关规定。

表3 10批消癌平注射液高效液相指纹图谱相对保留时间

表4 10批消癌平注射液高效液相指纹图谱相对峰面积

3 讨论

对甲醇－水，乙腈－水，甲醇－磷酸二氢钾缓冲液(磷酸调pH至3.0)，乙腈－0.1% 磷酸等不同组成、不同比例的流动相体系进行试验。结果峰形良好，保留时间稳定且分离度较好，故选用该系统为流动相。

本试验采用高效液相色谱法建立了消癌平注射液的指纹图谱，克服了只由单一化学成分作为质量控制指标的难题，为消癌平注射液的总体研究提供了更加系统和微观的信息。通过相似度计算可知，10批样品的相似度均在0.9以上，结果表明各样品指纹图谱虽存在一定差异，但均具有相同的色谱特征峰，且各色谱峰的保留时间匹配较好，说明所建立的指纹图谱具有较好的稳定性和可控性，为消癌平注射液的抗癌性成分在质量控制方面的研究提供了相关的理论参考依据，不足之处是尚需对高效液相色谱指纹图谱中特征指纹峰进一步指认。

[1]刘顺开.河南省新乡市前卫制药厂.消癌平有效成分的提取及剂型制备[P]:中国，92102027:1993－10－06.