动脉血流对深低温保存同种瓣膜活性的影响

景鹏宇，梁智星，梁法禹

活性同种瓣膜是心脏瓣膜置换较理想的材料［1，2］，其制备保存方法对瓣膜组织结构及细胞活性影响较大。在常规制取过程中，由于温度、压力等因素骤变，会导致瓣膜各层结构之间产生相互的内应力［3］，从而损伤瓣膜细胞。本实验模拟在体环境，就动脉血流在同种瓣的制备保存中的作用进行初步探讨，期望为改进其质量提供新方法。

1 材料与方法

1.1 实验动物 供体为1个月～1.5个月龄的中国白兔36只，雌雄不拘，体重（0.3±0.1）kg；受体为成年中国白兔12只，体重（3.0±0.5）kg，由山西医科大学动物中心提供。

1.2 移植物准备及分组1.2.1 灭菌培养液配置 RPMI1640营养液＋头孢呋辛钠50 μg／mL＋二性霉素B 2.5μg／mL（pH 值为7.2，渗透压为226 mOsm／kg）。

1.2.2 冻存液配置 RM11640培养液：10%小牛血清：二甲基亚砜（DMSO）为8∶1∶1，－20℃冻存［4］。

1.2.3 带瓣主动脉取材 供体兔腹腔注射戊巴比妥钠（40.0 mg／kg）麻醉，按常规动物实验方法暴露心脏，于主动脉弓分支前剪断。剥离带瓣主动脉，去除壁上结缔组织及脂肪组织。于主动脉瓣根部下缘保留约5mm的心肌纤维和心内膜，同时保留二尖瓣大瓣，将其修剪成瓣下主动脉壁的一部分。血管长1.2 cm～1.5cm，并缝扎两冠状动脉开口。

1.2.4 带瓣主动脉的灭菌培养 将修剪后的带瓣血管放入灭菌培养液中，在37℃ 含5%CO2的培养箱中灭菌12h。

1.2.5 分组 将以上标本随机分为A组、B组、C组。A组作为对照组，深低温液氮保存；B组、C组作为实验组，颈动脉移植后深低温液氮保存。

1.3 实验组处理

1.3.1 同种带瓣主动脉移植 受体兔耳缘静脉注射3%戊巴比妥钠（1mL／kg）麻醉，游离双侧颈动脉。将一侧颈动脉两端上动脉夹（间隔1.2cm～1.5cm），中间剪断。采用二定点法等弧度移植带瓣血管于受体颈动脉。吻合完毕后，让血管充盈排气。以同样的方法移植下一标本到对侧颈动脉。每侧吻合限时30min［5］。

1.3.2 术后管理 清醒后正常饮食，颈部切口不包扎每日消毒3次，给予阿司匹林肠溶片（25mg／d）。术后不使用抗生素。

1.3.3 移植成功标准 术后48h受体存活且颈动脉通畅、搏动良好。

1.3.4 取瓣膜标本 6只受体兔于术后48h，将植入的带瓣血管12份取出，作为B组。另6只于术后72h取出12份带瓣血管作为C组。

1.4 深低温保存 分别放入冻存液中4℃ 渗透平衡15min。使用程控降温仪以－1℃／min降温至－80℃ 保存12h，置入液氮罐中保存1个月，复温时直接40℃水浴，至解冻后取出主动脉瓣膜。

1.5 细菌学检查 灭菌后、从颈动脉取出后以及解冻后取样，做细菌培养，37℃、72h无细菌生长为阴性。

1.6 指标检测

1.6.1 HE染色及光镜观察 主动脉瓣膜用甲醛溶液固定，常规脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后5μm切片，行苏木精、伊红（HE）染色，用Olympus光学显微镜观察。

1.6.2 细胞活性检测 采用FDA（二乙酸荧光素）／PI（碘化丙啶）双染、流式细胞仪检测细胞活率。轻刮去上皮细胞，剪碎后放入装有10mL胶原酶Ⅱ（200μg／mL）的烧杯内，37℃ 水浴2 h，磷酸盐缓冲液洗涤，1 800r／min离心，取沉淀行FDA／PI双染色，300目尼龙网过滤，3min～5min内将细胞悬液通过流式细胞仪（488nm、200mV）计数。每份标本计数10 000个细胞，记录每个标本有活性细胞的百分比。

2 结 果

2.1 肉眼所见 B、C两组各发现1只白兔颈部切口感染，解剖后均发现瓣叶表面有血栓及赘生物附着。3组标本解冻后均呈苍白色，未见明显的瓣膜断裂、钙化等损伤，3组间差异无统计学意义。

2.2 光镜观察 3组标本纤维质层的胶原及弹性纤维清晰可见，室面层内膜面可见到不连续内皮细胞存在。低倍镜下B、C组一个视野内均见不到纤维质层的胶原及弹性纤维的回折（互成锐角可认为是回折）。A组在一个视野内可见到纤维质层的胶原及弹性纤维的回折数目为3个，其纤维质层总体皱缩程度较B组、C组大。3组室面层皱缩程度差异无统计学意义。

2.3 细胞活性（见表1） B组、C组均有1只兔出现切口感染，均未计入。

表1 3组细胞活率比较（±s） %

表1 3组细胞活率比较（±s） %

组别 n 细胞活率A组（0h）12 89.75±0.55 B组（48h） 11 90.68±0.371）C组（72h） 11 90.77±0.551）与A组比较，1）P＜0.05

3 讨 论

目前，临床使用的同种瓣膜多采用含抗生素的培养液灭菌、戊二醛／二甲基亚砜冷冻保护液处理，液氮深低温保存。临床应用显示了良好的近中期效果，其寿命在15年～20年［3］，但长期耐久性还有待提高。因此，如何改进同种瓣的制备保存方法，提高其保存质量，成为活性同种瓣移植基础和临床研究的热点。

瓣叶的基本组织结构分为三层：从内向外依次为有大量内皮细胞覆盖的心室面层，由疏松排列的胶原纤维、成纤维细胞和富含蛋白多糖的细胞外基质组成的海绵层，由成纤维细胞、其他类型的结缔组织和致密的胶原纤维束组成的纤维质层［6］。近年研究发现，在瓣膜制备保存中，即使是在零压力下固定，瓣叶的纤维质层和室面层之间仍存在相互对抗的内应力，室面层处于张力状态，伸展性较小，而纤维质层处于皱缩状态，具有良好的伸展性，这种残余应力会损伤瓣膜内部结构［3］。本实验显示动脉血流可使同种瓣纤维质层舒展，以减小纤维质层和室面层之间相互对抗的内应力对细胞的损伤，提高同种瓣细胞活率，对于瓣膜移植后的耐久性有更好的预期。

然而，在本实验中尚未进一步控制颈动脉血流速度、压力大小等因素，这将是下一步研究的方向。我们可以体外模拟颈动脉血流循环，更好地控制压力、温度、血压饱和度等相关因素，来处理供体瓣膜，更进一步方便于临床瓣膜制备保存，以减小瓣膜结构损伤，提高细胞活率。

动脉血流可减小瓣膜室面层与纤维质层之间的舒缩程度差异，减小瓣膜保存过程中的细胞损伤，其机制可能与动脉血流的机械力作用相关，还有待进一步研究。

［1］Malakh S，Nawid K，Hassina B，etal.Aortic root reoperation：A technical challenge［J］.J Heart Valve Dis，2010，19（2）：177－181.

［2］Jin XY，Zhang ZM，Gibson DG，etal.Effects of valve substitute on changes in left ventricular function and hypertrophy after aortic valve replacement［J］.Ann Thorac Surg，1996，62（3）：683－690.

［3］张宝林，徐志云.心脏瓣膜外科学［M］.北京：人民卫生出版社，2007：230－234.

［4］李新民，惠丽萍，刘建实，等.同种带瓣主动脉的制备及其保存［J］.中华胸心血管外科杂志，1995，11（1）：54.

［5］张晶，刘迎龙.兔颈动脉移植同种主动脉带瓣血管模型的建立［J］.中华实验外科杂志，2000，17（6）：568－569.

［6］Masoud M，Edgar B，Mahbubul L，etal.A new storage solution for porcine aortic valves［J］.Ann Thorac Cardiovasc Surg，2007，13（2）：102－108.