冠状动脉粥样硬化患者外周血蛋白激酶C受体蛋白表达与冠状动脉狭窄的关系

雷玉 平管军 郭亮 邢明青 王旭

·临床研究·

冠状动脉粥样硬化患者外周血蛋白激酶C受体蛋白表达与冠状动脉狭窄的关系

雷玉 平管军 郭亮 邢明青 王旭

目的探讨冠状动脉粥样硬化患者外周血蛋白激酶C受体蛋白(RACK1)的表达变化及与冠状动脉狭窄程度的关系。方法入选初诊为冠状动脉粥样硬化性心脏病的患者83例，根据冠状动脉造影结果，采用冠状动脉狭窄程度积分评价其狭窄程度。患者被分为4组:Ⅰ组(0分)即为对照组;Ⅱ组(1～10分);Ⅲ组(11～20分);Ⅳ组(＞20分)。采用实时荧光定量聚合酶链反应(realtime PCR)检测所有患者外周血RACK1 mRNA的表达情况。结果Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的RACK1 mRNA表达水平均显著高于Ⅰ组(t分别为10.62，12.90，14.00，均为P＜0.05)，而Ⅲ组和Ⅳ组又显著高于Ⅱ组(t分别为9.40和10.74，均为P＜0.05)，Ⅲ组、Ⅳ组两组间比较差异无统计学意义(t=1.43，P＞0.05)。相关分析显示，冠状动脉粥样硬化患者外周血RACK1 mRNA表达水平与冠状动脉狭窄程度存在相关性，相关系数rs=0.59(P＜0.01)。结论RACK1在冠状动脉粥样硬化患者外周血中表达上调，且与冠状动脉狭窄程度相关。

动脉粥样硬化，冠状动脉;蛋白激酶C受体蛋白;冠状动脉狭窄程度积分;实时荧光定量聚合酶链反应

冠状动脉粥样硬化性心脏病(CHD)是严重威胁人类健康的重要疾病，其病理基础是冠状动脉粥样硬化。目前国内外已有大量针对其发病机制的研究，产生了脂质渗入学说、平滑肌突变学说、炎症学说、内皮损伤学说、单核-巨噬细胞作用学说等多种学说来阐述冠状动脉粥样硬化的发生、发展。而研究冠状动脉粥样硬化发病的相关分子改变，有助于发现可能的治疗靶点。蛋白激酶C受体蛋白(receptor for activated C kinase 1，RACK1)是一种分子量为36000的含β-螺旋桨结构的支架蛋白，是WD重复蛋白(含色氨酸-天门冬氨酸重复序列的蛋白)家族成员之一，调节多条细胞内信号转导通路［1］。RACK1最初被鉴定为哺乳动物中蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的一种受体，协同βⅡPKC的胞内细胞信号通路［2-3］。而如今被视为一种胞浆内游离的支架蛋白，RACK1含7个WD40重复序列，通过不同的WD40位点，与细胞内多种蛋白相互作用，如PKC［4］、酪氨酸激酶、胰岛素样生长因子I［5-6］，参与细胞功能调控。目前，在动物中已发现80多种蛋白与RACK1相互作用，调节多条胞内信号通路［7-8］，并在酵母及植物RACK1的研究中取得了一些进展［9］。

PKC属于细胞信号转导中的磷脂酰肌醇信号传递途径，其功能表现为调控基因的表达和细胞周期，控制细胞膜的多种功能，参与炎症过程和免疫应答。研究表明，PKC升高在动脉粥样硬化形成过程中发挥重要作用［10］，血管平滑肌细胞的增生和分化都伴有PKC活性的增强，而前者与动脉粥样硬化的发生密切相关［11］。RACK1作为PKC的1个锚合蛋白，是否在冠状动脉粥样硬化发生发展过程中亦发挥重要作用，目前尚未见此方面相关研究。现已知RACK1广泛存在于哺乳动物多种组织以及外周血中［12］，本研究通过检测CHD患者血液中RACK1的表达情况，探讨其与冠状动脉狭窄程度的关系，以期探索CHD新的诊疗靶点。

1 对象和方法

1.1 研究对象

入选2011年1～7月在青岛大学医学院附属青岛市立医院心内科初诊为CHD的住院患者83例，年龄40～75岁，平均(62.3±9.6)岁。其中男性50例，女性33例。排除标准:严重肝、肾疾病及急、慢性感染性疾病、肿瘤、结缔组织病、纽约心功能分机Ⅳ级及其他不适合参加者。

1.2 冠状动脉狭窄程度评价

所有患者行冠状动脉造影，根据美国心脏学会/美国心脏协会(ACC/AHA)冠状动脉造影指南，采用Gensini评分系统对每支血管病变程度进行定量评定［13］。(1)根据冠状动脉狭窄程度进行基本评分:将冠状动脉狭窄25%、50%、75%、90%、99%和100%分别定为1、2、4、8、16和32分;(2)根据冠状动脉病变部位确定评分系数:左冠状动脉主干×5;前降支近段×2.5，中段×1.5，心尖支×1，第一对角支×1，第二对角支×0.5;回旋支近段×2.5，钝缘支×1，远段× 1，后降支×1，后侧支×0.5;右冠状动脉近段×1，中段×1，远段×1，后降支×1。以每一冠状动脉的狭窄评分乘以该病变部位的系数，即为该病变的评分。一位患者如有多处病变，则各病变的评分累计总和为该患者冠状动脉病变程度的总评分。根据最终积分将患者分为Ⅰ组(0分)、Ⅱ组(1～10分)、Ⅲ组(11～20分)、Ⅳ组(＞20分)，其中Ⅰ组为无冠状动脉粥样硬化的对照组。所有患者均签署知情同意书，研究方案通过医院伦理委员会批准。

1.3 RACK1 mRNA表达水平检测

1.3.1 主要试剂(1)引物由美国Invitrogen公司合成，序列如下:RACK1引物上游为CACATTGGCCACACAGGCTATC，下游为TGTAAAGGTGTTTGCCTTCGTTGA，扩增产物长度为124 bp;内参引物上游为GCACCGTCAAGGCTGAGAAC，下游为TGGTGAAGACGCCAGTGGA，扩增产物长度为138 bp。(2)Trizol试剂购自Invitrogen公司。(3)realtime PCR试剂盒购自日本TaKaRa公司。(4)人淋巴细胞分离液购自北京Solarbio公司。

1.3.2 标本处理及RNA提取83例患者均于冠状动脉造影术前1 d采静脉血4 ml，用枸橼酸钠抗凝剂抗凝，用人淋巴细胞分离液(Ficolli)分离外周血单核细胞后加入1 ml Trizol，经典法提取外周血总RNA。1.3.3 cDNA制备提取的RNA经1%琼脂糖凝胶电泳验证后，行反转录。20μl反转录体系包括:2 μl10×RTmix，2μl超纯dNTP，2μl Oligo-dT15，1μl Quant Reverse Transcriptase，13μl模板RNA。37℃孵育1 h。

1.3.4 real-time PCR检测25μl反应体系包括: 12.5μl SYBR Premix Ex Taq，0.5μl PCR Forward Primer，0.5μl PCR Reverse Primer，2μl DNA模板，9.5μldH2O。反应条件为:94℃预变性30 s，94℃15 s、59℃15 s和72℃30 s(38个循环)，72℃延伸10 min。反应仪器为Rotor-gene3000 Real-Time PCR System。目的基因表达阳性的标本荧光定量扩增曲线呈现S型，阴性标本成不规则波浪线。以2－ΔΔCt表示样品中目的基因mRNA相对表达量，其中ΔCt =样本Ct均值－内参Ct均值，ΔΔCt=ΔCt－(随机阴性对照样品Ct均值－该样品内参Ct均值)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 各组患者临床特征和基线水平比较

4组患者的性别、年龄、高血压、糖尿病、吸烟史等差异均无统计学意义(P＞0.05)，见表1。

2.2 各组样本RACK1 mRNA的表达情况

经统计学检验，RACK1 mRNA相对表达量符合正态分布。Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组的RACK1 mRNA表达水平均显著高于Ⅰ组(t分别为10.62，12.90，14.00，均为P＜0.05);而Ⅲ组和Ⅳ组的RACK1 mRNA表达水平又分别显著高于Ⅱ组(t分别为9.40和10.74，均为P＜0.05)，但Ⅲ组和Ⅳ组比较差异无统计学意义(t=1.43，P＞0.05)，见表2。各组RACK1及GAPDH扩增曲线呈S型(图1)，融解曲线为双峰，排除非特异性扩增及引物二聚体的出现(图2)。

2.3 RACK1 mRNA表达水平与冠状动脉狭窄程度的关系

Gensini积分为不连续变量，两者相关性分析采用Spearman等级相关，结果显示4组样本中，RACK1 mRNA表达水平与Gensini积分呈正相关，相关系数为rs=0.59(P＜0.01)。

图1 各组RACK1及GAPDH荧光定量扩增曲线

图2 各组RACK1及GAPDH荧光定量融解曲线

3 讨论

本研究分析CHD患者与无冠状动脉粥样硬化者RACK1表达水平在外周血中的差异，并借助Gensini积分来分析RACK1表达水平与冠状动脉狭窄程度的相关性。结果显示，CHD患者外周血中RACK1 mRNA表达水平均显著高于无冠状动脉粥样硬化者，提示RACK1在CHD患者外周血中表达上调。相关分析显示，CHD患者外周血RACK1 mRNA表达水平与冠状动脉狭窄程度存在相关性。

表2 各组样本RACK1 mRNA表达水平及冠状动脉狭窄积分(¯x±s)

RACK1作为一种锚定蛋白，可以与细胞中多种信号分子结合，参与细胞内许多信号通路的转导，从而在各种生命活动过程中扮演非常重要的角色，如细胞分裂、细胞凋亡、胞浆移动、细胞运动等。近年来的研究表明，异常表达的RACK1参与多种病理过程，如在口腔鳞癌、恶性黑色素瘤、肺腺癌、肺鳞癌、乳腺癌中表达异常，与这些肿瘤的发生、转移和临床分期密切相关［14］。RACK1作为一种新发现的骨成型蛋白受体Ⅱ的相互作用蛋白，属于一种肺动脉平滑肌细胞的反向调节因子，可能参与肺动脉高压的发病［12］。

现普遍认为有多种因素参与动脉粥样硬化，而氧化应激、内皮细胞功能紊乱、细胞异常增殖和凋亡以及细胞外基质失调是其发生、发展过程中的重要环节，其中NAD(P)H氧化酶、内皮源型一氧化氮合酶(endothelial-derived nitric oxide synthase，eNOS)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)和基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)则分别是这些环节中的关键酶［15］。PKC正是通过调节这些关键酶的活性及其表达，来参与动脉粥样硬化的发生、发展。据此我们推测RACK1作为PKC的一种常见锚定蛋白，可能通过作用于PKC途径，在冠状动脉粥样硬化疾病进程中发挥调节作用。典型的RACK1调控PKC的信号转导过程如下:RACK1与活化态PKC结合，将PKC定位到40S核糖体上并磷酸化起始因子elF6，磷酸化的elF6从60S核糖体亚基释放后允许60S亚基和40S亚基结合，从而形成80S核糖体并增强翻译活性，调控目的基因的表达［16］。RACK1参与冠状动脉粥样硬化发生、发展中的具体机制尚不清楚，可能为RACK1表达上调，与PKC相互作用，使PKC介导的信号通路翻译活性升高，从而导致NAD(P)H氧化酶、eNOS、MAPKs、MMPs等上述关键酶活性增高，进一步引起过度的氧化应激反应，内皮细胞损伤等不良过程，最终导致动脉粥样硬化的发生、发展。此推测有待进一步动物实验等后续研究证实，本研究结果为在冠状动脉粥样硬化发病中深入研究RACK1的作用机制和发展潜在的治疗靶点提供了理论依据。

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Expression of receptor for activated Ckinase 1 in peripheral blood and its relationship with the extent of coronary lesions in patients with coronary artery atherosclerosis

LEIYu-ping，GUAN Jun，GUO Liang，XING Ming-qing，WANG Xu.Department of Cardiology，the Affiliated Qingdao Municipal Hospital，Qingdao University Medical College，Qingdao 266071，China

GUAN Jun，Email:guanjun@medmail.com.cn
Thiswork was supported by a grant from Technological Fund Supported Program for Commonality of Qingdao (10-3-3-4-2-nsh)

ObjectiveTo explore the expression of receptor for activated C kinase 1(RACK1)in peripheral blood and its relationship with the extent of coronary lesions in patients with coronary artery atherosclerosis.MethodsA total of 83 patients with coronary artery atherosclerosis were enrolled. According to the results ofangiography，the extentof coronary stenosiswas evaluated by the coronary stenosis score.Patients were divided into four groups:groupⅠ(0 score，normal control group)，groupⅡ(1-10 scores);groupⅢ(11-20 scores)，and groupⅣ(＞20 scores).RACK1 mRNA expression in peripheral blood was detected by real-time polymerase chain reaction.ResultsThe RACK1 mRNA expression in peripheral blood in groupⅡ，groupⅢand groupⅣwere significantly higher than in groupⅠ(t=10.62，12.90，14.00，respectively，all P＜0.05).RACK1 mRNA expression in groupⅢandⅣwere significantly higher than in groupⅡ(t=9.40，10.74，respectively，both P＜0.05)，and there was no statistical significance between groupⅢand groupⅣ(t=1.43，P＞0.05).Correlation analysis showed that RACK1 mRNA expression in peripheral blood was positively correlated with the extent of coronary lesions(rs=0.59，P＜0.01).ConclusionsThe expression of RACK1 is up-regulated in peripheral blood in coronary artery atherosclerosis patients，and it is positively correlated with the extent of coronary lesions.

Atherosclerosis，coronary;RACK1;Gensini's degree integral;Real-time polymerase chain reaction

2012-01-11)

(本文编辑:谭潇)

10.3969/j.issn.1007-5410.2012.04.007

青岛市公共领域科技支撑计划项目(10-3-3-4-2-nsh)

266071青岛大学医学院附属青岛市立医院心内科

管军，电子信箱:guanjun@medmail.com.cn