乳酸菌对发酵豆乳风味成分的影响*

徐寅，黄玉军，顾瑞霞，陈霞，郭飞翔，陆春良，鲁茂林

1(江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室;扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州，225127)

2(扬州大学测试中心，江苏扬州，225009)

乳酸菌对发酵豆乳风味成分的影响*

徐寅1，黄玉军1，顾瑞霞1，陈霞1，郭飞翔1，陆春良2，鲁茂林1

1(江苏省乳品生物技术与安全控制重点实验室;扬州大学食品科学与工程学院，江苏扬州，225127)

2(扬州大学测试中心，江苏扬州，225009)

以实验室保藏的发酵豆乳感官特性具有差异的5株嗜热链球菌为对象，研究了乳酸菌α-乙酰乳酸脱羧酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶酶活和乳酸脱氢酶等关键酶的酶活性、发酵豆乳特性和挥发性风味成分间的相互关系。结果表明，发酵豆乳感官评价与乳酸菌的α-乙酰乳酸脱羧酶和α-半乳糖苷酶呈现显著负相关和正相关，与风味成分2，3-丁二酮、2-庚酮和2-壬酮呈显著正相关，与正己醇、2，4-癸二烯醛和2-戊基呋喃呈显著负相关;发酵豆乳酸度值与乳酸菌的β-半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶均呈显著正相关。

发酵豆乳，乳酸菌，风味

发酵豆乳是以大豆为主要原料，经乳酸菌发酵加工而成，它既保留了豆乳原有的营养价值，又由于乳酸菌的发酵赋予了发酵豆乳复杂的风味成分，同时能将大豆中的大分子物质如蛋白质、脂肪等加以分解，提高其消化吸收性能，并能代谢产生许多功能性成分。

发酵豆乳的风味是反应其质量的重要部分，同发酵豆乳的质地特性及产品安全性一样是消费者接受该产品时考虑的关键因素[1］。发酵豆乳的风味形成源于大豆原料及发酵过程[2］。目前，国内外关于发酵豆乳风味的研究主要集中在发酵条件、发酵菌种[3］、产品风味质量的感官评定[4］、豆乳发酵前后风味物质的比较[5］、添加牛乳[6］等物质对风味物质的影响等。本文对实验室保藏的5株嗜热链球菌发酵豆乳的挥发性风味成分进行检测分析，并结合感官评价和酶学特性，探讨影响发酵豆乳风味的因素，建立发酵豆乳风味定向调控技术，为开发符合消费需求的发酵豆乳制品打下基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆:产地东北，市售;全脂乳粉:新西兰威士兰乳业公司;5株嗜热链球菌(Streptococcus thermophi-lus)，菌株编号分别为 grx90、AM1、XN53、ST 和971-8，由扬州大学乳品生物技术与安全控制江苏省重点实验室保藏;邻硝基苯β-D-半乳糖苷(oNPG)、还原型辅酶Ⅰ(NADH)、对硝基苯 α-D-吡喃半乳糖苷(pNPG)、溶菌酶等购自上海生工生物有限公司;其他所用化学试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

FDM-Z100型自分离大豆磨浆机，江苏镇江大港晶久机械厂;FE20 pH计，梅特勒-托利多仪器有限公司;SCIENTZ-ⅡD超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司;台式冷冻离心机，美国Thermo公司;721可见分光光度计，上海棱光技术有限公司;SPX-250B型生化培养箱，上海跃进医疗器械厂;SPME手动进样器、75μm CAR/PDMS萃取纤维头，美国Supelco公司;Trace DSQ气相色谱-质谱联用仪，美国Thermo公司。

1.3 试验方法

1.3.1 发酵剂菌种的制备

将冻干的5株S.thermophilus(菌株编号分别为grx90、AM1、XN53、ST、971-8)分别于灭菌脱脂乳中，42℃培养活化3代备用。

1.3.2 发酵豆乳制备

精选大豆→浸泡(0.25%NaHCO3溶液浸泡14 h)→清洗、热烫→磨浆(85℃热水1∶8质量比磨浆)→过滤→豆乳和牛乳按7∶3(v/v)混合→加入蔗糖(6%)→ 均质(20 MPa)→热处理(90～95℃/15 min)→冷却(42℃)→接种不同乳酸菌发酵剂(3%接种量)→发酵(42℃)→冷藏(4℃)。

1.3.3 乳酸菌酶活性测定

将冻干的5株S.thermophilus分别接种于pH 6.4的改良MRS液体培养基中培养，42℃活化3代，收集对数生长期后期的菌体用于α-乙酰乳酸脱羧酶(α-ALDC)、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶酶活、乳酸脱氢酶(LDH)活性测定[7-9］。

1.3.4 发酵豆乳发酵特性分析

pH值采用精密pH计测定;酸度采用0.1 mol/L NaOH标准溶液滴定;活菌数采用平板菌落计数法测定。

1.3.5 发酵豆乳风味成分检测分析

[12-13］，并略作修改。吸取10 mL样品放入15 mL顶空瓶中，在45℃水浴中平衡20 min，将已老化好的萃取头插入样品瓶中，45℃条件下萃取40 min，然后进行GC-MS分析。

GC条件:色谱柱柱型:DB-WAX(30 m×0.25 mm，0.25 μm);进样口温度 250℃，解吸1min;采用程序升温方式:起始温度35℃，保留3 min，以5℃/min升至200℃，再以10℃/min升至230℃，保持10 min;载气(He)流速0.80 mL/min;不分流进样。MS条件:电离方式EI，70 eV，离子源温度为200℃，发射电流200μA，检测电压350 kV，质量扫描范围35～400 amu。

定性定量方法:通过对各组分计算机检索，并与NIST质谱库提供的标准质谱图对照，报道匹配度最大的结果，通过峰面积归一化法得到每种挥发性风味物质相对含量(挥发性物质的峰面积/总挥发性风味物质的峰面积，%)，测试样品重复试验1次，取平均值作为各风味物质相对含量。

1.3.6 发酵豆乳感官评价

选10名经培训合格的食品专业人员作为品评员，参考文献[3］，评定方法如下:采用嗅闻与品尝结合对不同乳酸菌发酵豆乳打分。评分标准:1)0～3分:无明显发酵香气，滋味难以接受;2)3～5分:有轻微发酵香气，滋味不柔和;3)5～8分:有正常发酵香气，滋味较柔和;4)8～10分:有浓郁发酵香气，滋味柔和。

1.3.7 统计学分析

使用spss17.0软件对数据进行统计学分析，除风味成分测定外，每组试验重复3次，实验数据表示为平均值±标准偏差。显著性分析采用t检验。

2 结果

2.1 不同乳酸菌酶活性测定结果

5株 S.thermophilus(菌株编号分别为 grx90、AM1、XN53、ST、971-8)在 MRS 培养基中酶活性测定结果如表1所示。

表1 乳酸菌酶活性测定结果1)

从酶活性测定结果可以看出，不同乳酸菌的酶活性存在差异，菌株grx90的α-乙酰乳酸脱羧酶活力显著低于其他菌株(P＜0.05);菌株971-8的α-半乳糖苷酶活力显著低于其他菌株(P＜0.01)，仅为0.545 U/mL，而菌株grx90的α-半乳糖苷酶活力显著高于其他菌株(P＜0.05);各菌株β-半乳糖苷酶活力均较低，其中菌株ST的β-半乳糖苷酶活力显著低于其他菌株(P＜0.01);各菌株的乳酸脱氢酶活力存在差异，在0.176～0.654 U/mL，其中菌株971-8的乳酸脱氢酶活力最大。

2.2 不同乳酸菌发酵豆乳特性比较

用5株S.thermophilus菌株分别制备发酵豆乳，发酵特性以及感官评价测定结果如表2所示。可以看出，不同乳酸菌发酵豆乳发酵结束时滴定酸度在45～56°T，pH 值在 4.52～4.62，乳酸菌活菌数在(1.02×108)～(2.45×108)CFU/mL，不同样品滴定酸度和活菌数均有显著差异(P＜0.05)，而pH值差异不显著(P＞0.05)。从感官评价发现，不同乳酸菌发酵豆乳呈味特征有较大差异，菌株grx90和AM1发酵豆乳感官评分较高，呈现浓郁并较为协调的发酵香气，而菌株ST和971-8发酵豆乳发酵香气较弱，并伴有令人不愉快的尖酸气息。

表2 不同乳酸菌发酵豆乳特性分析1)

2.3 不同乳酸菌发酵豆乳挥发性风味成分分析

对5株S.thermophilus发酵豆乳样品经4℃贮藏24 h后，以未发酵的豆乳为对照，采用HS-SPME-GCMS进行挥发性风味成分测定，结果见表3。

表3 发酵豆乳挥发性风味成分分析

续表3

未发酵豆乳共检测出35种主要挥发性风味成分，由醛、醇、酮、酸和呋喃构成，其中醛类占整个挥发性风味成分的比例最大，达到49.01%;其次是醇类24.01%;呋喃类13.02%;酮类10.84%。豆乳经不同乳酸菌发酵后，共检测出42种风味成分，豆乳发酵前后在风味构成成分、数量和相互比例上差异较大，酮、酸、醇类化合物种类及含量明显增加，醛类化合物则明显减少，呋喃类物质变化不大。不同乳酸菌发酵豆乳风味成分在总体组成上差别不大，含35种共有风味成分，但不同风味成分的含量存在差异。发酵豆乳中醇类所占比例最大，占发酵豆乳总挥发性风味成分的54.25%～57.15%;其次是酮类(17.38%～21.81%);呋喃类(11.68%～12.67%);酸类(6.26%～7.26%);醛类(4.56%～5.81%)。

3 分析与结论

3.1 乳酸菌酶活性与发酵豆乳特性相关性分析

对5株S.thermophilus的4个酶活性与发酵豆乳发酵特性及感官评价进行相关性分析，发现发酵豆乳感官评价与乳酸菌的α-乙酰乳酸脱羧酶和α-半乳糖苷酶分别呈现显著负相关和正相关;发酵豆乳酸度值与乳酸菌的β-半乳糖苷酶和乳酸脱氢酶均呈显著正相关，而发酵豆乳感官评价与酸度值间并未发现明显相关性(结果如图1所示)。

图1 乳酸菌酶活性、发酵豆乳酸度和感官评价相关性分析

3.2 发酵豆乳感官评价与挥发性风味成分相关性分析

不同的挥发性成分具有不同的呈味特征，对发酵豆乳风味起不同程度的贡献作用，根据呈味特性、相对含量、阈值，结合参考文献[12］，选取风味成分正己醇、1-辛烯-3-醇、1-壬醇、2，3-丁二酮、2，3-戊二酮、2-庚酮、2-壬酮、3-羟基-2-丁酮、己酸、辛酸、2-庚烯醛、2，4-癸二烯醛和2-戊基呋喃为研究对象，与发酵豆乳的感官评价做相关性分析，如表4所示。

表4 发酵豆乳感官评价和挥发性风味成分相关性分析

通过分析不同S.thermophilus菌株发酵豆乳的感官评价与挥发性风味成分相关性发现，发酵豆乳感官评价与多数酮类物质呈正相关，其中与2，3-丁二酮、2-庚酮和2-壬酮呈显著正相关，2，3-丁二酮的含量与α-乙酰乳酸脱羧酶活力呈显著负相关，可见在乳酸菌代谢豆乳中柠檬酸产生2，3-丁二酮的过程中，α-乙酰乳酸脱羧酶起到了关键作用。发酵豆乳与醇、醛和呋喃类的各主要成分均呈不同程度的负相关，其中与正己醇、2，4-癸二烯醛和2-戊基呋喃呈显著负相关，而与己酸、辛酸的相关性均不显著。

发酵豆乳的风味不是由单一风味成分所决定的，而是由醇、酮、酸、醛、呋喃等多类化合物共同作用构成。乳酸菌对发酵豆乳风味具有重要影响，通过研究发现，S.thermophilus grx90具有较弱的α-乙酰乳酸脱羧酶活力，产生了良好的发酵风味，从而获得较好的感官评价，是豆乳发酵的优选菌种。因此，在发酵豆乳微生物筛选过程中以酶学特性为指标定向筛选乳酸菌不失为一种研究方法。

参考文献

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[12]董喜梅.植物乳杆菌发酵豆乳风味物质的初步研究[D］.呼和浩特:内蒙古农业大学，2011.

ABSTRACTInfluence of Lactic Acid Bacteria on the Flavor of Fermented Soymilk Five Streptococcus thermophilus stored in laboratory with different sensory characteristics of fermented soymilk were studied.The activities of enzymes from lactic acid bacteria such as α-acetolactate decarboxylase(α-ALDC)，α-galactosidase，β-galactosidase ，and lactate dehydrogenase(LDH)，and the characteristics and flavor compounds of fermented soymilk were measured.Their correlation was also discussed.The results showed that the sensory evaluation of fermented soymilk was significant negatively and positively correlated with α-ALDC and α-galactosidase respectively，and was significant positively correlated with flavor compounds of 2，3-butanedione，2-heptanone and 2-nonylketone，was significant negatively correlated with hexanol，2，4-decadienal and 2-pentylfuran.Simultaneously，the acidity of fermented soymilk was significant positively correlated with β-galactosidase and LDH.

Key wordsfermented soymilk，lactic acid bacteria，flavor

Influence of Lactic Acid Bacteria on the Flavor of Fermented Soymilk

Xu Yin1，Huang Yu-jun1，Gu Rui-xia1，Chen Xia1，Guo Fei-xiang1，Lu Chun-liang2，Lu Mao-lin1
1(Jiangsu Province Key Lab of Dairy Biotechnology and Safety Control College of Food Science and Engineering，Yangzhou University，Yangzhou 225127，China)
2(Test Center of Yangzhou University，Yangzhou 225009，China)

硕士研究生(顾瑞霞教授为通讯作者)。

*江苏高校优势学科建设工程资助项目;国家863计划项目(2007AA10Z357);江苏省科技支撑项目(BE2011383);教育部博士点基金(20093250110005);2010年度“江苏省研究生教育创新工程”项目

2012-02-06，改回日期:2012-02-27