卵磷脂-β-环糊精包络物的抗氧化活性*

张泽，高淑悦，程继龙，颜士慧，李玉婷，李翀，张莉

(山东大学海洋学院，山东威海，264209)

卵磷脂-β-环糊精包络物的抗氧化活性*

张泽，高淑悦，程继龙，颜士慧，李玉婷，李翀，张莉

(山东大学海洋学院，山东威海，264209)

为了增强卵磷脂的抗氧化性能和水溶性，解决卵磷脂因存在稳定性差，不易溶于水等缺点而无法得到广泛应用的难题，通过将β-环糊精对卵磷脂进行包络，制备了卵磷脂-β-环糊精包络物，并用红外光谱和差热分析对包络产物进行了表征并检测了包络物的体内抗氧化活性。研究结果表明，用卵磷脂-β-环糊精包络物对小白鼠实施灌胃，能有效地降低小鼠肝脏中丙二醛(MDA)的含量，提高超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的活性。

卵磷脂，β-环糊精包络物，抗氧化

环糊精(Cyclodextrin，CD)是由若干个吡喃型葡萄糖单元以α-1，4糖苷键相结合成互为椅式构象的环状低聚糖，含有6、7和8个吡喃葡萄糖单元的环糊精分别叫做α-，β-和γ-环糊精，它们内腔呈锥形体，空腔内侧由氢原子及糖苷键合的氧原子构成，是疏水的，外腔则由于羟基的聚集而呈亲水性。“内疏水，外亲水”的分子结构，使其容易包结不同“客体”化合物形成特殊结构的包结物(inclusion complexes)[1］。这种包合作用可以改变被包结客体分子的理化性质，在许多领域得到应用。卵磷脂是一种从植物或动物中通过物理加工方法提取出来的磷脂混合物，一般用卵磷脂来统称这种混合物。卵磷脂是一种在动植物中分布很广的磷脂，是天然的乳化剂和营养补品。20世纪70年代以来，美国就把卵磷脂用于保健食品，总销量仅次于复合维生素和维生素E而名列第3[2］。据报道，卵磷脂在Cu、Fe、Mn等离子存在的情况下，具有很高的抗氧化活性[3］。此外，它还具有改善机体神经功能障碍及紊乱、恢复脑功能、增强记忆力、防止心血管系统疾病及抗衰老等功效[4-5］。步文磊等[6］通过研究有关卵磷脂对小鼠体内抗氧化体系的影响发现，卵磷脂能显著降低小鼠血清中MDA含量。然而，磷脂存在着氧化稳定性差，不易溶于水等缺点，影响了其广泛应用。为此谢文磊等[7］将β-环糊精与卵磷脂进行了包结，结果表明，约2分子的β-环糊精和1分子的卵磷脂依据范德华作用力和疏水作用力等发生包结作用，生成了稳定的包结化合物。而且卵磷脂通过包结后其溶解度和抗氧化能力均有所增加。

本文利用差热分析法和红外光谱分析法验证了β-环糊精与卵磷脂的包结作用，并对包结后产物的抗氧化活性进行了研究，旨在为开发一种新型的稳定性、水溶性强的磷脂类抗氧化功能性食品和药品提供的依据。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料

昆明种小鼠60只，18～22 g。雌雄各半，购于烟台绿叶制药有限公司。

1.1.2 试剂

卵磷脂:Sigma公司;β-环糊精:广东省郁南县环糊精厂，使用前二次重结晶，真空干燥;丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、总蛋白含量测试盒:南京建成生物工程研究所;其它试剂均为国产分析纯级。

1.1.3 设备

紫外可见分光光度计(U2008)，日本日立;集热式恒温磁力搅拌器，金坛市友联仪器研究所;真空干燥机，东莞市创瑞工业试验设备有限公司;JA2003N电子天平，上海精密科学仪器有限公司;HH-601电热恒温水浴锅，金坛市精达仪器制造厂;差热分析仪，Diamond TG/DTA 6300;美国Impact-400型傅立叶变换红外光谱仪，美国尼高力。

1.2 试验方法

1.2.1 卵磷脂-β-环糊精包络物的制备

包络物的制备工艺参考文献[7］进行。称取与一定质量卵磷脂摩尔比为2∶l的β-环糊精溶入水中，避光通氮气保护，在50～60℃加热搅拌下。加入卵磷脂，反应12 h，然后在室温下静置12 h，减压抽滤，粗产品分别用热水和甲醇充分洗涤，以除去残留的β-环糊精和卵磷脂，真空干燥后得到的白色粉末即为卵磷脂-β-环糊精包络物。

1.2.2 卵磷脂及其包络物差热分析鉴定

取卵磷脂和β-环糊精的物理混合物以及包络物2种样品在差热分析仪进行差热分析:称取5.0 mg左右样品，量程为±50 μV，升温范围为30～510℃，升温速率为10℃/min，以α-Al2O3为参比，作DTA图谱。

1.2.3 红外光谱分析

将卵磷脂和β-环糊精的物理混合物及卵磷脂-β-环糊精包络物用红外光谱作定性分析。

1.2.4 卵磷脂-β-环糊精包络物体内抗氧化活性试验

将60只昆明小白鼠随机分为6组，正常对照组(生理盐水组)、阳性对照组(VC组)、卵磷脂组及3个不同浓度的卵磷脂-β-环糊精包络物实验组。卵磷脂-β-环糊精包络物实验组每日每只灌胃卵磷脂-β-环糊精包络物溶液，低浓度组:50 mg/kg体重小鼠，中浓度组:100 mg/kg体重小鼠，高浓度组:200 mg/kg体重小鼠;卵磷脂实验组灌胃200 mg/kg体重小鼠;阳性对照组灌胃VC100 mg/kg体重小鼠;正常对照组灌胃同体积生理盐水，连续20天。实验期末，动物禁食12 h后处死小鼠，取出肝脏测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力、超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量。

1.2.5 考马斯亮兰法测定蛋白含量

考马斯亮兰测定小鼠组织(肝脏)蛋白的方法依照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行。

1.2.6 测定样品MDA含量、SOD和GSH-PX活性

分别依照南京建成生物工程研究所试剂盒说明书进行。其中超氧化物歧化酶(SOD)活力定义为每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时对应的SOD量为1个SOD活力单位(U);谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)活力是以催化GSH的反应速度来表示，定义为每毫克蛋白，每分钟扣除非酶反应的作用，使反应体系中GSH浓度降低1 μmol/L为一个酶活力单位。

1.3 统计方法

实验数据采用SPSS 10.0进行处理，以平均值±标准差(±SD)表示，以P＜0.01为差异极显著，以P＜0.05为差异显著，P＞0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 包络物的表征

2.1.1 差热分析

从图1和图2中可以看出，卵磷脂和β-环糊精的包络物以及两者物理混合物的图谱有明显不同。二者的物理混合物在140℃和330℃出现放热峰，在285℃和440℃出现吸热峰，而在包络物的图谱上各个峰的位置和形状都发生了变化，说明卵磷脂已经被包络到β-环糊精的空腔中。

图1 卵磷脂-β-环糊精包络物的热差示分析图谱

图2 卵磷脂和β-环糊精物理混合物的热差示分析图谱

2.1.2 红外光谱

将卵磷脂和β-环糊精的物理混合物及卵磷脂-β-环糊精包络物做红外光谱分析。结果如图3所示，可以看出在1990～2400cm-1包络物和物理混合物存在较大差异，这进一步证实了卵磷脂已经被β-环糊精包络。

2.2 卵磷脂-β-环糊精包络物对小鼠肝脏中MDA含量和SOD和GSH-PX活性的影响

图3 卵磷脂和β-环糊精的物理混合物及其包络物的红外光谱图

MDA是氧自由基氧化细胞膜上磷脂形成的脂质过氧化物的稳定存在形式，可反映机体内脂质过氧化的程度。脂质过氧化作用不仅把活性氧转化为活性化学剂，即非自由基性的脂类分解产物，而且通过链式或链式支链反应，放大活性氧的作用。因此，初始的一个活性氧能导致很多脂类分解产物的形成，这些分解产物中，一些是无害的，另一些则能引起细胞代谢及功能障碍，甚至死亡。氧自由基化合物不但通过生物膜中不饱和脂肪酸(PUFA)的过氧化引起细胞损伤，而且还能通过脂氢过氧化物的分解产物引起细胞损伤。因此测试MDA的量常常可反映机体内脂质过氧化的程度，间接地反映出细胞损伤的程度。超氧化物歧化酶(SOD)对机体的氧化和抗氧化平衡起着至关重要的作用，此酶能清除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤。谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)是机体内广泛存在的一种重要的催化H2O2分解的酶。它特异的催化还原性谷胱甘肽(GSH)对H2O2还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整性的作用。因此，SOD和GSH-PX活性的高低也是反映机体清除自由基能力的重要指标[8］。

肝脏是人体重要的解毒和代谢器官。当自由基作用于肝细胞的胞膜和内质网，便开始引发膜磷脂的不饱和脂肪酸的过氧化，进而导致膜的通透性升高。过氧化作用的产物同时又可以抑制内质网膜和细胞膜上的蛋白质合成(如葡萄糖-6-磷酸酶和细胞色素P-450系统)和某些酶的活性[9］，从而导致肝功能失调。因此研究抗氧化剂对肝脏的抗氧化能力意义十分重大。

各实验组小鼠连续灌胃20 d后，小鼠肝脏组织中MDA含量、SOD和GSH-PX活性测定结果见表1。结果显示:在对肝脏MDA含量影响方面，与空白对照组相比，VC组、卵磷脂组、卵磷脂-β-环糊精包络物各剂量组均显著降低了小鼠肝脏中MDA含量(P＜0.05);与VC组相比，卵磷脂组、卵磷脂-β-环糊精包络物各剂量组不呈现差异显著性(P＞0.05);与卵磷脂组给药同等剂量的卵磷脂-β-环糊精包络物高剂量组与卵磷脂组相比，MDA的含量相差不大，说明被β-环糊精包络后的卵磷脂与未包络的卵磷脂相比具有相似的降低小鼠肝脏中MDA含量的功效。在对肝脏SOD活性影响方面，与空白对照组相比，VC组、卵磷脂组显著提高了小鼠肝脏中SOD活性(P＜0.05)，卵磷脂-β-环糊精包络物各剂量组均极显著提高了小鼠肝脏中SOD活性(P＜0.01);与VC组相比，卵磷脂-β-环糊精包络物中剂量组显著提高了小鼠肝脏中SOD活性(P＜0.05)，卵磷脂-β-环糊精包络物高剂量组极显著提高了小鼠肝脏中SOD活性(P＜0.01)，与卵磷脂组给药同等剂量的卵磷脂-β-环糊精包络物高剂量组与卵磷脂组相比，SOD的活性更高，说明包络后的卵磷脂具有更强的提高小鼠肝脏SOD活性的能力。在对肝脏GSH-PX活性影响方面，与空白对照组相比，卵磷脂组显著提高了小鼠肝脏中GSH-PX活性(P＜0.05)，VC组和卵磷脂-β-环糊精包络物各剂量组均极显著提高了小鼠肝脏中GSH-PX活性(P＜0.01);与VC组相比，卵磷脂组呈现极显著性差异(P＜0.01)，卵磷脂-β-环糊精包络物低剂量组呈现显著性差异，卵磷脂-β-环糊精包络物中、高剂量组不呈现差异显著性(P＞0.05)，与卵磷脂组给药同等剂量的卵磷脂-β-环糊精包络物高剂量组与卵磷脂组相比，具有更高的GSH-PX活性，说明包络后的卵磷脂具有更强的提高小鼠肝脏GSH-PX活性的能力。

表1 灌胃20 d的小白鼠肝脏中GSH-PX活力、SOD活力和MDA含量变化(±SD)

表1 灌胃20 d的小白鼠肝脏中GSH-PX活力、SOD活力和MDA含量变化(±SD)

注:与对照组比较 a P ＜0.01，b P＜0.05;与 VC组比较 cP＜0.01，dP＜0.05。

组别 包络物剂量/1036.41±8.3227.16±4.572.60±0.68 VC010450.31±45.01a42.49±1.72b0.56±0.09b卵磷脂 010191.98±59.92bc41.59±2.35b0.62±0.04b低剂量组 5010316.04±42.15ad60.98±8.57a0.66±0.24b中剂量组 10010444.98±65.28a64.74±9.26ad0.59±0.06b高剂量组 20010432.85±68.58a94.64±5.70ac0.65±0.13)］对照[mg·(kg·d)-1]动物数量/只 GSH-PX活力/V SOD活力/U[U·mg-1(prot)］MDA含量/[(nmol·mg-1(prot 0 b

试验证明，卵磷脂-β-环糊精包络物可提高小鼠肝脏中SOD和GSH-PX活性，降低MDA含量。在对小鼠肝脏SOD和GSH-PX两方面活性的影响方面，卵磷脂-β-环糊精包络物与卵磷脂相比显示出了更好的活性。在对小鼠肝脏MDA含量影响方面，卵磷脂-β-环糊精包络物和卵磷脂的活性相似，二者都能明显降低小鼠肝脏的MDA含量。

3 讨论

氧在生物体内通过单电子还原产生化学性质活泼的物质，既活性氧(ROS)，包括超氧阴离子、羟基自由基等。它们可与DNA、蛋白质和多元不饱和脂肪酸作用，造成DNA的断裂和氧化性损伤，蛋白-蛋白交联，蛋白-DNA交联等，从而造成生物体氧化损伤，并进一步引起癌症、衰老、心血管等慢性病[10］。对于抗氧化剂的研究，已经成为最为活跃的研究课题之一[11-12］。

用β-环糊精对卵磷脂进行包络制得包络物，经过体内药理试验结果可知，卵磷脂-β-环糊精包络物可提高小鼠肝脏中SOD和GSH-PX活性，降低MDA含量。在提高小鼠SOD、GSH-PX活性方面，卵磷脂-β-环糊精包络物比卵磷脂的活性更加显著;在降低小鼠肝脏MDA方面，卵磷脂-β-环糊精包络物和卵磷脂的活性相似，二者都能明显降低小鼠肝脏的MDA含量。

在所测定的3项指标中包络后的卵磷脂都比未包络的卵磷脂要好。此外，磷脂的氧化主要发生在不饱和键上，而不饱和键主要位于β位脂肪酰基上，而且β-环糊精空腔外部为亲水性，相对地增加了分子的亲水性，因此卵磷脂通过包结抗氧化性能和亲水性增加。在一定温度下将卵磷脂和包结化合物加热一定时间后分别测定其过氧化值，实验结果说明包结化合物的过氧化值和过氧化值随加热时间增长的增加量均较卵磷脂为小，表明了通过与β-环糊精的包结作用，卵磷脂的抗氧化能力增加[7］。这样就解决了卵磷脂存在的氧化稳定性差，不易溶于水等问题，可以使卵磷脂得到更加广泛的应用。其次，本试验的操作方法简单易行，对实验的仪器设备的要求不是很高，投入工业化生产的可行性和可操作性都很强，具有巨大的开发价值和发展前景。

[1]张有明，彭晓霞，魏太保等.β-环糊精与两性表面活性剂相互作用[J］.无机化学学报，2002，18(8):773-776.

[2]赵建滨，杨官娥.鱿鱼卵中卵磷脂的提取[J］.山西医科大学学报，2000，31(6):504-505.

[3]吴胜芳，顾小红，张灏，等.卵磷脂的功能特性及其应用[J］.食品科技，2001(4):36-38.

[4]Safford F.Testing the effects of dietary lecithin on the memory in the elderly:A example of social work/medical research collaboration[J］.Research on Social Work Practice ，1994，4:349.

[5]Barenholz Y.Sphingomyelin in bilayer and biological membranes[J］.Biochim Biophys Acta，1980，604:129.

[6]步文磊，赵显峰，荫士安，等.辅酶Q10、大豆甙元以及卵磷脂对小鼠体内抗氧化体系的影响[J］.食品科学，2010，31(7):256-259.

[7]谢文磊，徐卫河，冯光炷.紫外光谱法研究β-环糊精与卵磷脂的包结作用[J］.光谱学与光谱分析，2001，21(5):707-709.

[8]Vassalle C，Lubrano，et a1.Determination of Mitric puls nitrate and malodialdehyde in human lasma:analytical performance and the effect of smoking and exercise[J］.Clinical chemistry and laboratory Medicine，2005，40(8):802-809.

[9]Cheeseman KH，Ingold KU.Carbon tetrachloride toxicity as a model for studying free radical mediatedn liver injury[J］.Philos Trans R Soc Cond Biol，1985，311(1152):633-645.

[10]Cui J，Li CL，Hong XN.Bio-antioxidants with ill therapy[J］.J Tsinghua Univ，Sci Tech，2000，40(6):9-12.

[11]Noguchi N，Watanabe A，Shi H.Diverse functions of antioxidants[J］.Free Radic Res，2001，33(6):809-817.

[12]Yokozawa T，Dong E，Nakagawa F.In vitro and in vivo studies on the radical scavenging activity of tea[J］.Agric Food Chem ，2000，46(6):2143-2150.

ABSTRACTTo improve the antioxidation ability and water-solubility of phosphatidylcholine，phosphatidylcholine was inclusion with β-cyclodextrin.The antioxidative activity of phosphatidylcholine-β-cyclodextrin was studied and analyzed by infrared spectrum and athermalization.The results showed that after mice administered intragastrically with phosphatidylcholine-β-cyclodextrin，the level of MDA was reduced and the activities of SOD and GSH-PX were increased in liver.

Key wordsphosphatidylcholine，inclusion compound of β-cyclodextrin，antioxidation

Study on Antioxidation of Phosphatidylcholine with β-Cyclodextrin Compound Inclusion

Zhang Ze，Gao Shu-yue，Cheng Ji-long，Yan Shi-hui，Li Yu-ting，Li Chong，Zhang Li
(Marine College，Shandong University，Weihai 264209，China)

本科(张莉教授为通讯作者)。

*山东大学第六届大学生科研立项重点项目(A11005)

2012-03-10，改回日期:2012-05-10