超高压液相色谱质谱联用法检测磷脂酰胆碱

黄 漩，生庆海，，*，张志国，孙亚范

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司研发中心，内蒙古呼和浩特 011500；3.乳品食品监测中心，天津 300381）

超高压液相色谱质谱联用法检测磷脂酰胆碱

黄 漩1，生庆海1，2，*，张志国2，孙亚范3

（1.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030；2.内蒙古蒙牛乳业（集团）股份有限公司研发中心，内蒙古呼和浩特 011500；3.乳品食品监测中心，天津 300381）

采用超高压液相色谱-串联四级杆质谱仪（UPLC-MS/MS）（配有电喷雾离子源）法检测磷脂酰胆碱（PC），先使用气相色谱分析可能包含的PC分子种类，再根据气相色谱分析结果，UPLC-MS/MS进行准确的定性和定量。UPLC的流动相：A相为水，B相为乙腈∶甲醇=5∶5，A∶B=10∶90，流速为0.4mL/min，PC大约在4min时出峰。 最低检出限为1μg/L，相关系数为0.99936，加标回收率为95.6%～98.4%。

超高压液相色谱，电喷雾质谱，气相色谱，磷脂酰胆碱

Abstract：The phosphatidylcholine was detected with UPLC-MS/MS （equipped with electrospray ionization source）.Gas chromatography（GC） was used to analysis PC molecular species，according to the results of GC，and then UPLC-MS/MS be used to accurate qualitative and quantitative.The mobile phase of UPLC：A，water.B，acetonitrile∶methanol=5∶5，A∶B=10∶90，had flow rate of 0.4mL/min.Under this condition，the retention time of PC was about 4min.The regression coefficient was 0.99936 and the limit of detection was 1μg/L.The recovery was in the range of 95.6%～98.4%.

Key words：Ultra Performance LC（UPLC）；electrospray ionization mass spectrometry；gas chromatography；phosphatidylcholine

磷脂酰胆碱（Phosphatidylcholine，PC）是生命的物质基础，是生物膜的主要组成成分，同时也是一种天然的表面活性剂，在食品、医药、化妆等诸多方面被广泛的应用[1]，随着对卵磷脂的深入研究，卵磷脂有了狭义和广义之分，广义的卵磷脂包含PC、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇等，狭义的卵磷脂就是PC[2]。检测技术的进一步发展，使PC的结构更清晰，根据分子种类的不同，知道PC并不是一种单一物质，而是许多结构相似物质的统称[3]。PC分子的结构特点是一个脂酰基被磷酸胆碱基所取代，磷酸胆碱基连接在甘油基的第3碳位上称α型[4]，在自然界中存在的PC为L-α-PC。PC中磷酸基与酯化的醇部分一起构成极性头基，两条长的烃链组成非极性尾部。甘油磷脂分子中sn-1和sn-2位上酯化的是各种组合的天然脂肪酸，一般说，PC的C1（R1CO-）位上连接的是饱和脂肪酸，主要是棕榈酸（16∶0）或硬脂酸（18∶0）；C2（R2CO-）位上是不饱和脂肪酸，主要是18碳不饱和脂肪酸，如油酸（18∶1）、亚油酸（18∶2）和亚麻酸（18∶3）[5]。通过气相色谱先分析出PC的C1、C2位上含哪种脂肪酸，根据PC的结构特点分析出可能存在的PC分子种类，再用质谱进行深入的研究，鉴定所推测的PC分子种类是否存在。质谱检测方法更加快速，准确，保留时间在4min左右，使PC的检测方法更加简单。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

混合卵磷脂标准品 Fluka公司，有等量的磷脂酰胆碱、脑磷脂和磷脂酰肌醇，饱和脂肪酸24%，单不饱和脂肪酸14%，多不饱和脂肪酸62%；奶粉 不添加磷脂酰胆碱；乙腈、甲醇 默克化工业务，色谱纯；氯仿、正己烷 天津市永大化学试剂有限公司，分析纯；甲酯化试剂 4mol/L KOH/甲醇溶液；高纯氮；工业氮。

AcQuity超高压液相色谱-质谱联用仪（UPLC-MS/MS） 配有电喷雾离子源及MassLynx V4.1处理系统，美国Waters公司；GC-7890A气相色谱 配有FID检测器及Agilent ChemStation处理系统，安捷伦公司；纯水仪 德国默克密理博公司；离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司；振荡器 德国IKA公司；水浴锅 东莞市粤泰实验设备有限公司；氮吹仪北京成萌伟业科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 标准液的配制 混合卵磷脂标准品，称取1.0000g标准品，溶于100mL氯仿∶甲醇=9∶1（v∶v）中，浓度为10mg/mL。

1.2.2 甲酯化 甲酯化：取1mL A标准液用氮气吹干，加入2mL正己烷溶解，再加入1mL KOH/甲醇溶液，混匀，静置分层，取上清液上机[6]。

气相色谱条件：色谱柱J＆W 122-1032：325℃；30m×250μm×0.25μm；载气N2；载气流速1.0mL/min；进样口温度260℃；分流比30∶1；检测器温度280℃；柱温箱温度初始温度140℃，保持5min，以4℃/min升温至240℃，保持15min；进样量1μL[7]。

1.2.3 UPLC条件 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH®C18，2.1mm×100mm，1.7μm。流动相：A为水，B为乙腈∶甲醇=5∶5，A∶B=10∶90；柱温：30℃；进样量：5μL。

1.2.4 质谱条件 电喷雾在正离子模式下，毛细管电压3.5kV；脱溶剂气温度350℃；脱溶剂气流量500L/h；离子源温度120℃。

1.2.5 加标回收实验 各取0.4、0.8、1.0mL的标准液分别定溶于100mL的容量瓶中，得到40、80、100μg/mL的标准液。称取奶粉10.00g共六份到烧杯中，每两份加入一个同样浓度的标准液，加入30mL甲醇，确保甲醇完全覆盖样品。在45℃水浴中保温10min，向烧杯中加入60mL氯仿，继续保温15min，适当搅拌。在布氏漏斗中加两张滤纸，过滤烧杯中的溶液到圆底烧瓶中，然后连接到旋转蒸发仪上，在50℃下蒸发至近干，用40mL氯仿∶甲醇=9∶1的溶液溶解，过0.22μm的滤膜，上机[8-9]。

2 结果与讨论

2.1 标准曲线

通过UPLC-MS/MS，用优化的方法测得的磷脂酰胆碱标准品的总离子图，见图1。

图1 PC标准质谱图Fig.1 The standard spectrum of PC

在优化的质谱条件下，取不同浓度的标准品溶液，以响应值为纵坐标，进样量为横坐标作图，见图2，得到线性回归方程为y=6.9300x+0.6899，相关系数0.99936，最低检出限是1μg/L。

2.2 气相色谱方法

图2 不同浓度的PC标准溶液与峰面积的线性关系Fig.2 The linear relationship between different concentrations standard and peak area of PC

运用甲酯化方法，可以推测出C1位和C2位连接的脂肪酸，因为质谱检测方法需要建立在所测样品分子质量已知的情况下，所以对于未知的PC样品，应该先进行甲酯化，用气相色谱检测出标准品中所含的脂肪酸种类，见图3。

根据PC的脂肪酸组成推测出可能存在的分子结构，见表1。根据推测出的磷脂酰胆碱的种类，用优化的质谱条件进行定性分析，检测出该标准品中磷脂酰胆碱的种类。

表1 常见的磷脂酰胆碱分子的种类[10]Table 1 The species of common phosphatidylcholine molecular[10]

2.3 流动相的选择

根据标准品的溶剂，文献以及仪器的条件，选择用乙腈与甲醇的配比和水作为流动相。经过一系列的实验选择出一个合适的流动相配比。

由图4-A，流动相是乙腈∶甲醇=7∶3，峰型不好，有严重的拖尾现象；图4-B是乙腈∶甲醇=6∶4，峰型一般，出峰时间延后；图4-C是乙腈∶甲醇=5∶5，峰形良好，无拖尾现象，而且出峰快速。三个图的对比可得出适合的流动相为90%的乙腈∶甲醇=5∶5和10%的水。

2.4 质谱优化条件

图4 对比不同流动相的色谱图Fig.4 The comparison of different mobile phase chromatogram

质谱仪在建立新的方法时，需要先知道待测样品的质荷比（m/z），再进行全扫描，主要选择适合的锥孔电压，找到响应值最大的电压，开启氩气进行子离子的扫描，对碰撞电压进行修改，选择响应值较大且稳定的离子作为子离子，一个子离子用作定性，另一个子离子用作定量。最后优化出的质谱条件，见表2。

表2 优化的质谱条件Table 2 The optimization of MS/MS conditions

2.5 加标回收实验

按照1.2.5的处理方法得到的加标回收率，结果见表3。其加标回收率为95.63%～98.40%。

表3 加标回收率Table 3 The recovery of standard addition

3 结论

UPLC-MS/MS法检测PC更快速、灵敏，使PC的检测更加简单，再加上气相色谱的辅助，可以深入到各种分子结构PC的检测，使PC产品的含量更加透明化，精密度和稳定性均符合要求，此法的检测速度符合现在人们对效率的高要求，更适合现在的社会发展趋势。

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Method of UPLC-MS/MS about phosphatidylcholine detection

HUANG Xuan1，SHENG Qing-hai1，2，*，ZHANG Zhi-guo2，SUN Ya-fan3
（1.Food Science College of Northeast Agricultural University，Harbin150030，China；2.R&D Center，Inner Mongolia Mengniu Dairy（Group）Co.，Ltd.，Huhhot 011500，China；3.Dairy Food Monitoring Center，Tianjin 300381，China）

TS207.3

A

1002-0306（2012）16-0096-03

2012-02-09 *通讯联系人

黄漩（1986-），女，硕士研究生，研究方向：食品科学。