湖南、江西产侗药血马鞭的总三萜含量测定△

郑钦方 汪 冶

(1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128;2.怀化医学高等专科学校中医药现代化研究中心，湖南 怀化 418000)

血马鞭是一种侗族药物，其植物来源为马鞭草科(Verbenaceae)紫珠属(Callicarpa L.)植物广东紫珠(Callicarpa kwangtungensis Chun)的干燥全株，中国药典2010年版收载的广东紫珠，其入药部位是干燥地上部分［1］。血马鞭具有收敛止血，散瘀，清热解毒的功效。主要用于治疗咯血，便血，崩漏，肺热咳嗽，咽喉肿痛，热毒疮疡，水火烫伤［1］。

血马鞭的主要化学成分为黄酮类、三萜类、苯丙素糖苷类等［2］。近年来，研究较多的为黄酮类成分，对三萜类成分研究较少。血马鞭中三萜主要为齐墩果酸、熊果酸、白桦酸［3，4］，其中熊果酸和齐墩果酸具有抗炎、保肝、抗肿瘤、抗HIV、抗菌、抗溃疡、降血糖和降血脂等功效［5］。全国有18家制药企业生产抗宫炎片或抗宫炎胶囊，因血马鞭药材需求量大，现湖南怀化、江西萍乡等地已开展大规模栽培，为更好的开发血马鞭资源，特对血马鞭中的总三萜含量测定进行研究，以对血马鞭的质量进行评价，为开发利用提供科学依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器:UV－4802型紫外可见分光光度计(上海尤尼柯仪器有限公司)，KQ－250DB型超声仪(昆山市超声仪器有限公司)，PS－80AL超声仪(深圳市科洁超声科技公司)HZK－FA－210电子天平(美国华志)。

1.2 药材:血马鞭样品分别为湖南怀化会同县连山基地栽培药材，湖南怀化雪峰山野生药材，怀化郊区林下自然生长药材，江西萍乡的大田栽培1年生和多年生药材，经怀化医学高等专科学校汪冶教授鉴定，均为马鞭草科紫珠属植物广东紫珠。采收的广东紫珠药材均使用阴干法干燥。

1.3 试剂与试药:齐墩果酸对照品购于中国药品生物制品检定所(批号:110709－200505)，无水乙醇、香草醛、高氯酸、冰醋酸等均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 血马鞭总三萜成分含量测定方法的建立

2.1.1 显色方法及测定波长的选择:分别精密吸取齐墩果酸对照品溶液和供试品溶液适量至具塞试管中，水浴挥干溶剂，各加入新配置的5%香草醛－冰醋酸0.3mL，高氯酸1.0mL，密塞摇匀，于60℃水浴中加热 10min，取出立即置冰浴中冷却，加入冰醋酸5mL，摇匀。以空白试剂为对照，于200～800nm波长范围内进行扫描，结果对照品溶液和供试品溶液在546nm处有最大吸收，故选取546nm为测定波长。

2.1.2 标准曲线的绘制:精密称取干燥至恒重的齐墩果酸标准品4.2mg置于50 mL的量瓶中，加入无水乙醇超声溶解，稀释至刻度，摇匀，即质量浓度为0.084 mg·ml－1的标准品溶液。分别精确吸取标准品溶液 0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 于具塞试管中，水浴挥尽溶剂，按“2.1.1”项下方法，在546nm波长下测定吸光度。以齐墩果酸质量浓度为纵坐标，吸光度为横坐标，绘制标准曲线，回归方程为:y=0.1894x+0.0029，R2=0.9992。结果表明齐墩果酸在0.0084 ～0.084mg·ml－1浓度范围内，浓度与吸光度呈现良好的线性关系。

2.2 血马鞭总三萜提取方法的考察

表1 正交实验设计

2.2.1 正交实验设计:经过单因素考察，选择乙醇浓度(A)、超声温度(B)、提取时间(C)、超声功率(D)，4因素作为考察对象，每个因素3个水平，以提取物中总三萜类含量为评价指标，用L9(34)正交试验表进行正交试验，其因素水平选取见表l，实验结果见表2。

表2 超声提取正交实验结果

2.2.2 正交实验考察结果:对血马鞭总三萜超声提取结果的数据进行直观分析，可以看出，影响因素顺序为C＞D＞A＞B，即超声提取时间对总三萜得率影响最大，提取温度对总三萜得率影响最小。根据分析结果得到最佳提取工A2B2C3D1，即乙醇浓度85%，提取温度为40℃，提取时间30min，超声功率250W。

2.3 供试品溶液制备方法:精密称取各血马鞭样品约2g，加10倍85%乙醇，40℃，250W超声提取30min，过滤，提取3次，合并3次提取液，置于旋转蒸发仪中蒸干，残渣加无水乙醇15ml，超声溶解，加活性炭适量，70℃水浴15min脱色，趁热过滤，加无水乙醇定容至25mL，作为供试品溶液。

2.4 方法学考察

2.4.1 精密度实验:精密吸取齐墩果酸对照品溶液适量于具塞试管中，平行测定5份，按“2.1.1”项下方法显色，测定吸光度，计算含量。结果RSD=0.50%(n=5)。

2.4.2 稳定性考察:精密吸取齐墩果酸对照品溶液适量于具塞试管中。按“2.1.1”项下方法显色，放置 l0，20，30，40，50，60 min后，分别测定吸光度，计算含量。结果在对照品在60min 内稳定，RSD=1.55%(n=6)。

2.4.3 重现性考察:精确称取同一批血马鞭样品5份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下方法显色，分别测定吸收度，计算含量。结果RSD=0.87%(n=5)。

2.4.4 回收率试验:精确称取已知含量的血马鞭样品，准确加入齐墩果酸对照品，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.1.1”项下方法显色，平行测定5份。结果平均加样回收率为:98.5%，RSD=1.45%(n=5)。

2.5 不同产地血马鞭总三萜含量测定:精密吸取各供试品溶液50μL于具塞试管中，按“2.1.1”项下方法显色，根据标准曲线分别计算总三萜的含量。结果见表3。

表3 湖南、江西产血马鞭总三萜含量

3 小结与讨论

3.1 本研究采用正交实验，得到了血马鞭总三萜的最佳提取方法，该提取方法简便易行，对血马鞭研究具有指导意义。

3.2 含量测定结果表明，湖南、江西产血马鞭总三萜含量有差异，其中湖南怀化会同县栽培的血马鞭总三萜含量最高，怀化郊区林下自然生长的血马鞭总三萜含量最低。江西萍乡栽培的1年生及多年生血马鞭总三萜含量相近，没有显著差异。

3.3 本实验所选样品，为10月份采收，10月份以前及11月份以后的总三萜含量有待进一步研究。

3.4 湖南怀化雪峰山野生血马鞭与湖南怀化郊区林下自然生长的血马鞭光照不足，水分相对充足，总三萜含量较低，这可能是总三萜的富集与光照、水分胁迫有关。湖南怀化会同栽培的血马鞭生长在山上，光照非常充足，且比较干旱，总三萜含量较高。说明总三萜含量与光照条件、干旱胁迫有关。提示血马鞭的栽培不应在林下进行，不能作为林下药材栽培或与其他作物套种。至于水分胁迫、干旱胁迫与光照作用对总三萜的富集影响情况有待下文研究。

［1］国家药典委员会.中国药典2010年版.一部［S］.2000:40.

［2］聂韡，朱培林，黄丽莉，等.广东紫珠药材的研究进展［J］.中国现代中药，2011，13(9):37.

［3］周伯庭，李新中，徐平声，等.广东紫珠地上部位化学成分研究(I)［J］.中南药学，2004，2(4):238-239.

［4］陈艳华，冯锋，任冬春，等.广东紫珠地上部分的化学成分［J］.中国天然药物，2008，6(2):120-122.

［5］盛艳乐，赵大球，周春华，等.植物熊果酸和齐墩果酸分析的研究进展［J］.中国农学通报:2009，25(23):347.