猴头菌液体静置发酵液的化学成分与细胞毒活性

郑永标，鲁春华，许 莉，郑忠辉，苏文金*，沈月毛*

1福建师范大学生命科学学院，工业微生物教育部工程研究中心，福建省现代发酵技术中心，福州 350108;2山东大学药学院，济南 250012;3厦门大学生命科学学院，厦门 361005

培养方式对微生物次级代谢产物有重要的影响。近期，我们采用液体静置培养方式对食药用价值较高的猴头菌进行发酵培养，对发酵液的有机粗提物进行了细胞毒测定，发现猴头菌液体静置发酵液具有较高的细胞毒活性，为进一步阐明其中具有细胞毒活性的化学成分，我们扩大培养量，对其中的化学成分进行分离，本文对所分离并结构确定的化合物进行报道。

1 材料与仪器

1.1 材料

1.1.1 菌种

猴头菌(Hericium erinaceus)由福建农林大学菌物中心谢宝贵教授提供。

1.1.2 培养基

PD培养基。200 g马铃薯浸汁(马铃薯去皮，切成小块，煮沸20 min，6层纱布过滤)，葡萄糖20 g，水 1 L，pH 自然。

1.1.3 分离介质

柱层析硅胶(200～300目)和薄层层析板(0.20～0.25 mm，GF254)购自青岛海洋化工总厂。反相硅胶(RP-18)，Merck产品。凝胶层析硅胶(Sephadex LH-20)，Amersham Biosciences产品。

1.2 仪器

中压液相色谱仪:BUCHI。旋转蒸发仪:BUCHI，EYELA，STUART。核磁共振波谱仪:Bruker ARX 600。质谱仪:API 2000 LC/MS，Applied Biosystems。酶标仪:M-3550，BioRad。

2 提取与分离

2.1 猴头菌的液体静置发酵培养

猴头菌斜面菌种先接种到装有150 mL PD培养基的三角瓶中，于恒温摇床中培养，温度28℃，转速200 rpm，制备猴头菌液体菌种。取150 mL PD猴头菌液体菌种接种到装有3 L PD培养基的大三角瓶，共培养9瓶，于25～28℃培养室培养54 d。猴头菌液体静置发酵后，过滤除去菌丝体，发酵液先真空浓缩至1 L，再用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯层用无水硫酸钠脱水后浓缩，再用甲醇溶解过滤，得甲醇可溶粗提物 8.3 g。

2.2 猴头菌化学成分的纯化

猴头菌粗提物(8.3 g，褐色浸膏)用适量甲醇充分溶解，经反相硅胶柱(170 g)层析，甲醇-水梯度(水，30∶70，50∶50，70∶30，甲醇和丙酮)分别洗脱1.5、2、3、2、1 和1 L，压力正常后流速控制为40 mL/min，每管收集250 mL，TLC检测合并相似的组分，分别由30%甲醇、30%甲醇、30%甲醇、50%甲醇和70%甲醇洗脱得到 Fr.1(307 mg)、Fr.2(212 mg)、Fr.3(1.3 g)、Fr.4(1.2 g)和 Fr.5(884 mg)5 个主要组分。

Fr.1(307 mg)经适量甲醇充分溶解，经凝胶(40 g)柱层析，甲醇洗脱，流速约为4～6 drop/min，每试管收集5 mL，相似组分合并得到两个主要组分Fr.1.1(97 mg)和 Fr.1.2(186 mg)。Fr.1.1(97 mg)经反相硅胶(10 g)柱层析，10%甲醇洗脱得主要组分34 mg，接着经凝胶(40 g)柱层析，丙酮洗脱得主要组分21 mg，最后经正相硅胶柱层析，石油醚-丙酮(10∶1)洗脱，TLC检测得到化合物6(13 mg)。Fr.1.2(186 mg)经反相硅胶(10 g)柱层析，甲醇-水 (7.5∶92.5，15∶85，25∶75)梯度洗脱，分别从7.5%、7.5%和15%甲醇洗脱得3个主要组分Fr.1.2.1(92 mg)、Fr.1.2.2(48 mg)和 Fr.1.2.3(36 mg)。Fr.1.2.1(92 mg)接着经凝胶(40 g)柱层析，甲醇洗脱得2个主要组分Fr.1.2.1.1(52 mg)和Fr.1.2.1.2(20 mg)。Fr.1.2.1.1(52 mg)接着经凝胶(40 g)柱层析，丙酮洗脱得主要组分30 mg，最后经正相硅胶柱层析，石油醚-丙酮(8∶1)洗脱TLC检测得到化合物3(10 mg)。Fr.1.2.1.2(20 mg)经正相硅胶柱层析，石油醚-丙酮(20∶1)洗脱，TLC检测得到化合物4(2 mg)和5(4 mg)。

Fr.4(1.2 g)先经凝胶(140 g)柱层析，甲醇洗脱得主要组分40 mg，再经凝胶(50 g)柱层析，丙酮洗脱得到主要组分2 mg，接着经正相硅胶柱层析，石油醚-丙酮(20∶1)洗脱，TLC检测得到化合物2(1.4 mg)。

Fr.5(884 mg)先经凝胶(140 g)柱层析，甲醇洗脱得主要组分884 mg，接着经反相硅胶(30 g)柱层析，甲醇-水(60∶40，70∶30)梯度洗脱，70% 甲醇洗脱得到主要组分135 mg，再连续经凝胶柱层析，分别以甲醇和丙酮为洗脱剂，得到主要组分14 mg，最后经正相硅胶柱层析，石油醚-丙酮(6∶1)洗脱TLC检测得到化合物1(6 mg)。

3 结构鉴定

化合物1为白色胶状物，可溶于丙酮与甲醇，ESI-MS(m/z 515.4［M+Na］+和 m/z 531.1［M+K］+)，分子式 C27H40O8;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:9.42(1H，s，H-15)，7.08(1H，d，J=5.2，H-13)，5.81(1H，t，J=8.6，H-11)，4.54(1H，d，J=5.2，H-14)，4.32(1H，d，J=7.4，H-1')，3.89(1H，dd，J=11.5，5.3，H-5'α)，3.54(1H，m，H-4')，3.37(1H，overlapped，H-3')，3.30(1H，overlapped，H-2')，3.23(1H，m，H-5'β)，2.85(1H，m，H-18)，2.65(1H，m，H-10α)，2.36(2H，m，H-2)，2.12(1H，d，J=10.7，H-5)，2.04(3H，s，H-22)，1.93(1H，m，H-10β)，1.83(1H，m，H-7α)，1.69(1H，m，H-8α)，1.58(1H，m，H-8β)，1.55(1H，m，H-1α)，1.48(1H，m，H-1β)，1.45(1H，overlapped，H-7β)，1.07(3H，s，H-16)，1.03(3H，s，H-20)，1.02(3H，s，H-19)，1.00(3H，s，H-17);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:194.0(C-15)，172.0(C-21)，160.3(C-13)，140.7(C-3)，138.5(C-12)，138.3(C-4)，107.7(C-1')，86.2(C-14)，78.0(C-3')，75.3(C-2')，71.2(C-4')，68.9(C-11)，67.0(C-5')，50.4(C-9)，45.9(C-6)，41.0(C-5)，39.5(C-8)，38.1(C-1)，31.3(C-7)，30.1(C-10)，29.3(C-2)，28.3(C-18)，24.9(C-17)，22.2(C-19)，21.8(C-20)，20.9(C-22)，16.8(C-16)。与文献［1］核磁数据相比较，确定化合物1的结构为二萜糖苷化合物erinacine P(图1)，为从猴头菌菌丝体中分离到，本文首次从猴头菌发酵液中分离到该化合物。

图1 猴头菌静置发酵液的化学成分Fig.1 Chemical structures of compounds isolated from H.erinaceus

化合物2为白色粉状物，溶于丙酮与甲醇，ESIMS(m/z 175.4［M+Na］+)，分子式 C8H8O3;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:6.10(1H，d，J=2.2，H-3)，6.21(1H，d，J=2.2，H-5)，2.50(3H，s，H-7)，10.1(1H，s，H-8);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:194.3(C-8)，167.5(C-4)，167.2(C-2)，114.1(C-1)，146.2(C-6)，111.9(C-5)，101.5(C-3)，18.4(C-7)。与文献［2］的核磁数据对比确定化合物2的结构为 orsellinaldehyde(图1)，orsellinaldehyde是灰树花(Grifola frondosa)的深层发酵产物，本文首次从猴头菌发酵液中分离到该化合物。

化合物3为无色油状物，可溶于丙酮与甲醇，ESI-MS(m/z 171.2［M+H］+，m/z 193.1［M+Na］+)，分 子 式 C8H10O4;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:7.96(1H，s，H-6)，6.29(1H，s，H-3)，4.79(3H，q，J=6.4，H-7)，4.43(2H，s，H-1)，1.36(3H，d，J=6.4，H-8);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:178.7(C-4)，169.6(C-2)，152.4(C-6)，133.5(C-5)，112.4(C-3)，63.6(C-7)，60.9(C-1)，23.2(C-8)。数据分析表明该化合物为已知化合物 herierin IV［3］(图1)。

化合物4为无色油状物，可溶于丙酮与甲醇，ESI-MS(m/z 143.3［M+H］+，m/z165.2［M+Na］+)，分 子 式 C7H10O3;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:5.62(1H，s，H-3)，4.64(1H，m，H-6)，4.17(1H，d，J=16.7，H-1a)，4.13(1H，d，J=16.7，H-1b)，2.54(1H，dd，J=17.0，13.0，H-5α)，2.47(1H，dd，J=17.0，4.0，H-5β)，1.48(3H，d，J=6.4，H-7);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:194.7(C-4)，178.5(C-2)，100.7(C-3)，76.3(C-6)，60.4(C-1)，42.2(C-5)，19.0(H-7)。经与文献［4］核磁数据比较，确定化合物4的结构为吡喃酮衍生物 erinapyrone A(图1)。

化合物5为无色油状物，可溶于丙酮与甲醇，ESI-MS(m/z 143.0［M+H］+，m/z 165.0［M+Na］+)，分 子 式 C7H10O3;1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:5.37(1H，s，H-5α)，4.51(1H，m，H-2)，3.87(1H，dd，J=12.3，3.4，H-1a)，3.76(1H，dd，J=12.3，5.0，H-1b)，2.68(1H，dd，J=17.0，14.0，H-3α)，2.35(1H，m，H-3β)，2.08(3H，s，H-7a);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:194.4(C-4)，176.2(C-6)，103.5(C-5)，79.9(C-2)，62.6(C-1)，36.0(C-3)，19.6(C-7)。其核磁数据与文献［4］的一致，确定化合物5的结构为吡喃酮衍生物erinapyrone B(图1)。

化合物6为无色油状物，可溶于丙酮与甲醇，分子式 C8H10O5，ESI-MS(m/z209.1［M +Na］+)，1H NMR(600 MHz，CD3OD)δ:5.66(1H，s，H-3)，5.75(1H，s，H-6)，4.16(1H，d，J=16.7，H-7a)，4.07(1H，d，J=16.7，H-7b)，4.40(3H，q，J=6.5，H-8)，1.23(3H，d，J=6.5，H-9);13C NMR(600 MHz，CD3OD)δ:170.9(C-2)，101.2(C-3)，190.2(C-4)，64.6(C-5)，81.0(C-6)，59.8(C-7)，61.0(C-8)，16.8(C-9)。其核磁数据与文献［4］的一致，确定化合物6的结构为吡喃酮衍生物erinapyrone C(图1)。

4 Erinacine P细胞毒活性测定

把培养好的HeLa细胞制成单细胞悬液，用血细胞板计数并稀释至细胞浓度为6×104个/mL。于96孔板中接种细胞，每孔80 μL。另设3孔无细胞、仅有80 μL培养液的用于仪器调零的空白对照孔。置37℃，5%CO2的培养箱中培养24 h，然后加入20 μL化合物erinacine P使其浓度分别为24 μM和48 μM。同时，往阳性对照孔加20 μL顺铂使终浓度为10 μg/mL，往阴性对照孔和空白对照孔各加20 μL 培养液。继续培养 72 h，每孔加10 μL 5 mg/mL MTT。37 ℃ 反应 3 h，每孔加 100 μL 10%SDS和0.01 mol/L HCl溶解过夜。酶标仪比色测定(波长595 nm)。抑制率按下式计算。

Erinacine P细胞毒活性测定结果见表1。经SPSS 18.0统计分析表明，空白对照组、顺铂和48 μM erinacine P实验组的吸光值无显著差异，而阴性对照组和24 μM erinacine P实验组差异显著，结果说明顺铂和48 μM erinacine P完全抑制HeLa细胞的生长，抑制率为100%，而24 μM erinacine P的抑制率为88%。erinacine P显示了较强的细胞毒性活性。

表1 Erinacine P的细胞毒活性测定Table 1 Cytotoxity investigation results for erinacine P by MTT assay

5 讨论

猴头菌子实体具有较高的食用与药用价值，本文通过对猴头菌静置发酵液化学成分分离与活性实验，表明猴头菌的静置发酵液也具有较高的药用价值。据报道，本文首次从猴头菌中分离到化合物orsellinaldehyde(2)，经流式细胞仪分析表明其可诱导人肝癌 Hep 3B细胞凋亡的作用［2］;化合物 erinacine P(1)，erinapyrone A(4)和 erinapyrone B(5)对HeLa细胞都具有细胞毒活性［4］。猴头菌的人工栽培时间较长，子实体生长管理影响因素较多，限制了其药用价值的开发，本文的研究为猴头菌的开发应用提供了新的途径，若进一步研究其深层发酵生产具有较高药用活性价值的化学成分的工艺，则可通过工业发酵的方式来实现。

1 Kenmoku H，Sassa T，Kato N.Isolation of erinacine P，a new parental metabolite of cyathane-xylosides，from Hericium erinaceum and its biomimetic conversion into erinacines A and B.Tetrahedron Lett，2000，41:4389-4393.

2 Lin JT，Liu WH.O-orsellinaldehyde from the submerged culture of the edible mushroom Grifola frondosa exhibits selective cytotoxic effect against Hep3B cells through apoptosis.J Agr Food Chem，2006，54:7564-7569.

3 Qian FG(钱伏刚).，Xu GY(徐光漪)，Du SJ(杜上钅监)，et al.Isolation and identification of two new pyrone compounds from the culture of Hericium.Acta Pharma Sin(药学学报)，1990，25(7):522-525.

4 Arnone A，Cardillo R，Nasini G，et al.Secondary mold metabolites:part 46.Hericenes A-C and erinapyrone C，new metabolites produced by the fungus Hericium erinaceus.J Nat Prod，1994，57:602-606.