基于响应曲面法的龙须藤多糖提取条件优化

蔡亮亮，余方荣，李西海，叶蕻芝，徐慧凤，刘献祥*

1福建中医药大学药学院;2福建中医药大学中西医结合研究院，福州 350108

龙须藤(Bauhinia championii Benth)又称梅花入骨丹、九龙藤，系双子叶植物豆科类羊蹄甲属植物多年生藤［1］，具有祛风除湿、行血气之功效，主治跌打损伤，风湿骨痛、心胃气通［2］。主要分布在福建、广东、江西等地，尤其在福建福州永泰县青云山地区资源丰富。龙须藤多糖是龙须藤的主要有效成分之一，在治疗骨性关节炎方面具有较高的应用开发价值;影响多糖的提取率因素很多，其中，提取温度、提取时间、料液比、提取次数是主要因素。响应曲面法是评价指标和因素间的非线性关系的一种试验设计方法，其原理是通过一些列确定性试验拟合为一个响应面来模拟真实的极限状态曲面，从而很容易的进行可靠性分析［3］。目前多种植物多糖用响应曲面法进行测定，都能得到较高的提取率［4-6］，因此，本文在单因素试验的基础上，结合响应曲面法，对龙须藤多糖的提取工艺进行优化，以期为龙须藤多糖的产业化开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

LXJ-低速大容量多管离心机(上海安亭科学仪器厂)，DU-640紫外可见分光光度计(美国Beckman公司)。D-无水葡萄糖对照品(中国药品生物制品检定所，批号:110833-200904)，无水乙醇、苯酚、浓硫酸(分析纯);龙须藤经福建中医药大学药学院杨成梓副教授鉴定。

1.2 方法

1.2.1 龙须藤多糖的提取

精密称取粉碎干燥后的龙须藤粉末5 g，石油醚脱脂并干燥，置圆底烧瓶中，按照设定好的条件(提取温度、提取时间、料液比、提取次数)进行回流提取，提取液趁热抽滤，制备多糖水提液，将其浓缩并定容至50 mL。分别量取上述定容溶液10 mL置50 mL离心管中，加40 mL无水乙醇，摇匀，4℃醇沉过夜、离心，沉淀加水溶解，转移至50 mL容量瓶，定容。

1.2.2 龙须藤多糖标准曲线制备

根据苯酚-硫酸法［7］，精密称取葡萄糖标准品10 mg置100 mL容量瓶中水溶解并定容，制备100 μg/mL的溶液。精密吸取葡萄糖标准溶液0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7 mL 置 7 个干燥具塞试管中，加蒸馏水使最终体积均为1 mL，摇匀，分别加入5%苯酚溶液1 mL，摇匀，迅速滴加浓硫酸5 mL，充分摇匀沸水浴15 min，室温冷却15 min，于490 nm波长处测定吸光度。龙须藤多糖按照上述方法测定吸光度，计算多糖含量。

1.2.3 多糖提取率的计算

多糖提取率/% =多糖质量/药材质量 ×100%

1.2.4 单因素试验

固定提取时间3 h、料液比1∶25、提取2次的条件下，分别以60、70、80、90、100℃进行提取，考察提取温度对多糖得率的影响。

固定温度100℃、料液比1∶25、提取2次的条件下，分别提取2、3 、4 、5、6 h，考察提取时间对多糖得率的影响。

固定温度100℃、提取时间3 h、提取2次的条件下，分别在料液比 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 的条件下提取，考察料液比对多糖得率的影响。

固定温度100℃、提取时间3 h、料液比1∶25的条件下，分别提取1、2、3、4次，考察提取次数对多糖得率的影响。

1.2.5 响应曲面优化法试验

根据单因素试验结果，每个单因素选取提取率比较高的3个水平，借助试验设计软件Design-Expert.8.05b，采用 Box-Behnken 设计法。因素编码水平见表1。

表1 试验因素水平编码Table 1 Levels and factors of polysaccharides extraction test

2 结果

2.1 多糖标准曲线的绘制

按1.2.2项操作，得出各份溶液的吸光度值 ，以多糖含量为横坐标，吸光度值为纵坐标，得回归方程:Y=0.0091X-0.0132，R=0.9989

2.2 单因素结果分析

2.2.1 提取温度对龙须藤多糖得率的影响

精密称取5份5 g的龙须藤，加入料液比为1∶25的水，提取2次，每次3 h，将温度分别设定在60、70、80、90、100℃，研究温度对龙须藤多糖提取率的影响，见图1。

由图1可知，在60-100℃温度范围内，随着提取温度的升高，多糖得率显著增加，升高到90℃，再提高温度，多糖得率增加幅度较小，考虑到能耗及多糖在较高温度下易降解，选择90℃较适宜。

图1 温度对多糖提取率的影响Fig.1 Effects of temperature on the extraction rate of polysaccharide

2.2.2 提取时间对龙须藤多糖得率的影响

精密称取5份5 g的龙须藤，加入料液比为1∶25的水，100℃、提取2次的情况下，将时间设定在2、3、4、5、6 h，研究时间对龙须藤多糖提取率的影响，见图2。

由图2可知，在2～3 h之间，随着提取时间的延长，多糖得率显著增加，3～5 h之间多糖得率增幅较小，在提取5 h后，多糖得率反而下降，提取时间的延长，其它成分也被提取出来，因此提取时间选择3 h较合适。

图2 提取时间对多糖提取率的影响Fig.2 Effects of extraction time on the extraction rate of polysaccharide

2.2.3 料液比对龙须藤多糖得率的影响

精密称取5份5 g的龙须藤，100℃、提取2次、每次 3 h、将料液比设定在 1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，研究料液比对龙须藤多糖提取率的影响，见图3。

由图3可知，在料液比较低时随着料液比的增大，多糖得率也在增大，料液比在1∶25时多糖得率最高，料液比超过1∶25时，多糖得率反而下降;这是由于增大料液比可以使物料与溶剂接触面积增大，使多糖被充分的提取出来，但料液比过大，也使其它成分被过多溶出，消耗能量与时间，因此，料液比为1∶25时较为合适。

图3 料液比对多糖提取率的影响Fig.3 Effects of ratio of material to solvent on the extraction rate of polysaccharide

2.2.4 提取次数对龙须藤多糖得率的影响

精密称取5份5 g的龙须藤，加入料液比为1∶25 的水，100 ℃提取3 h;提取1、2、3、4 次，研究提取次数对龙须藤多糖提取率的影响，见图4。

由图4可知，在提取3次时，多糖得率较高，考虑到提取成本，因此选择提取3次较为合适。

2.3 响应曲面实验

图4 提取次数对多糖提取率的影响Fig.4 Effects of extraction times on the extraction rate of polysaccharide

2.3.1 采用Box-Behnken设计，以提取温度、提取时间、料液比、提取次数为自变量，根据单因素试验结果，设计四因素三水平的响应面试验，实验设计与结果见表2利用Design-Expert.8.05b软件对数据进行分析，得二元多项回归方程:Y=2.42+0.34A+0.27B-0.078C+0.24D+0.29AB-0.31AC-0.1AD-0.053BC-0.23BD+0.07CD-0.078A2-0.18B2-0.72C2+0.079D2。从表3可以看出模型的一次项提取温度是极显著的(P＜0.0001)，一次项提取时间(P=0.0002 ＜0.001)是极显著的，提取次数(P=0.0005＜0.001)是极显著的。交叉相中温度与时间(P=0.0063 ＜0.01)、温度与料液比(P=0.0036 ＜0.01)是高度显著的、时间与次数(P=0.026＜0.05)是显著的。二次项中提取时间(P=0.021＜0.05)是显著的，提取料液比(P＜0.0001)是极显著的，表明各个影响因素不是线性关系。整体模型的 P＜0.0001，表明二次方程模型显著，模型的失拟项P值为0.3922，大于0.05，说明模型选择合适，并且该模型的总回归系数为R2=94.43，说明该模型与实际试验拟合较好，可用于龙须藤多糖水浸提实验的理论预测。

表2 Box-Behnken设计实验结果Table 2 Box-Behnken experiment design and the results

10 -1 0 0 -1 1.96 1.74 11 0 0 1 -1 1.29 1.23 12 0 0 0 0 2.19 2.42 13 1 1 0 0 2.95 3.06 14 0 0 0 0 2.47 2.42 15 -1 0 1 0 1.46 1.52 16 -1 0 -1 0 1.09 1.04 17 -1 0 0 1 2.58 2.42 18 0 1 0 1 2.69 2.60 19 0 1 -1 0 1.98 1.91 20 1 0 1 0 1.64 1.57 21 0 0 0 0 2.62 2.42 22 0 -1 -1 0 1.39 1.28 23 1 -1 0 0 1.93 1.95 24 0 0 1 1 2.03 2.01 25 0 1 0 -1 2.73 2.57 26 0 -1 0 1 2.47 2.51 27 1 0 0 1 2.81 2.90 28 0 -1 0 -1 1.61 1.59 29 -1 -1 0 0 1.71 1.84

表3 回归分析结果Table 3 Results of regression analysis

2.3.2 响应曲面及等高线分析

图5-10是根据回归模型作出的相应的等高线与响应面，显示了不同的交叉因素对多糖得率的影响。等高线图上圆形表示交互作用不明显，曲率半径较大的椭圆则表示交互作用显著，并且曲率半径越大交互作用越显著;在等高线图上，在最大的椭圆上取值，多糖得率最低，在最小的椭圆上取值，则表示多糖得率最高，它们之间的等高线反映了多糖得率的变化;响应面的最高点同时也是等高线最小椭圆的中心点［8］。由表3知各因素对多糖提取率的影响因素为:提取温度与料液比＞提取温度与提取时间＞提取时间与提取次数＞料液比与提取次数＞提取时间与料液比。

3 结论

本实验运用近几年发展起来的分析方法-响应曲面法对龙须藤多糖的提取工艺进行优化，通过此分析方法建立了水浸提龙须藤多糖的二次多项式模型，对影响多糖提取率的因素及其交互作用进行探讨。由 Design-Expert.8.0.5b软件分析处理，确定龙须藤多糖提取的最佳工艺为:提取温度100℃、提取时间4 h、料液比为1∶23.2、提取次数为2次，考虑到实际的操作条件，将龙须藤多糖的提取条件修改为:提取温度100℃、提取时间4 h、料液比为1∶23、提取次数为2次，理论计算提取率为3.12%，在此基础上验证，提取率为2.98%，与预测值比较接近;此实验优选出龙须藤多糖的提取实验条件，可以为龙须藤药材开发、质量控制提供实验基础。

1 Bai HY(白海云)，Zhan QF(詹庆丰)，Xia ZH(夏增华)，et al.Studies on the chemical constituents in vine stem of Bauhinia championii.Chin J Chin Mater Med(中国中药杂志)，2005:30:42-43.

2 Compile Group of Compliation of Countrywide Herbal Medicine of China(《全国中草药汇编》编写组).Compliation of countrywide Herbal Medicine of China(全国中草药汇编).Beijing:People's Medicial Publishing House，1996.374.

3 Muralidhar RV，Chirumamila RR.A response surface approach for the comparison of lipase production by Candida cylindracea using two different carbon sources.Biochem Engin J，2001，9:17-24.

4 Huang S(黄森)，Zha XQ(查学强)，Luo JP(罗建平)，et al.Studies on the Extraction of Active Polysaccharide from Dendrobium Huoshanense with Box-Behnken Method.Chin Med Mat(中药材)，2007:591-594.

5 Meng XJ(孟宪军)，Li DN(李冬男)，Wang YQ(汪艳群)，et al.Response Surface Methodology as An Approach for Optimization of Extraction of Water-soluble Polysaccharides from Schisandra chinensis(Turcz.)Baill.Food Sci(食品科学)，2010，31:111-115.

6 Li G(李光)，Li XL(李学兰)，Sun HF(孙慧峰)，et al.Optimization of Extraction of Dendrobium candidum Polysaccharides Using Response Surface Methodology.Mod Chin Med(中国现代中药)，2011，13(9):29-33.

7 Zhang WJ(张惟杰).Biochemical research technology of glycoconjugates(糖复合物生化研究技术).Hangzhou:Zhejiang University Press，201l:128-185.

8 Wang AL(王安良)，Yun X(云霞)，Yang H(杨红).Study on the process of the Dioscorea opposite Thunb by microwave-assisted extraction using response surface methodology.Food Sci Technol(食品科技)，2007，194(12):86-90.