糯米香茶中角鲨烯含量的RP-HPLC测定

杨 婷，孙智达，谢笔钧，胡崇琳

华中农业大学食品科学技术学院，武汉 430070

糯米香茶(Strobilanthes tonkinesis Lindau)，为爵床科马蓝属多年生草本植物［1］。因其具有独特的糯米清香而得名，它含有丰富的芳香成分和对人体有益的氨基酸，具有清热解毒、养颜抗衰、补肾健胃的功效，被誉为“美容茶”［2］。近年来研究人员发现糯米香茶中含有丰富的生物活性物质角鲨烯，使得糯米香茶成为提取角鲨烯的潜在植物资源，有待进一步开发利用。

角鲨烯是一种高度不饱和的直链三萜类化合物，化学名称为 2，6，10，15，19，23-六甲基-2，6，10，14，18，22-二十四碳六烯酸，具有抗氧化、抗辐射、抗疲劳、增强免疫调节及新陈代谢等作用［3］。角鲨烯最早发现于深海鲨鱼肝脏中，后研究人员从植物中提取得到不同含量的角鲨烯，其中谭乐和等人发现糯米香茶中角鲨烯含量较为丰富［4］，但尚未建立准确测定糯米香茶中角鲨烯含量的检测方法。本文在前人的基础上建立一种反相高效液相色谱(RPHPLC)准确测定糯米香茶中角鲨烯含量的方法，为进一步的研究工作奠定基础。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

仪器:waters e2695高效液相色谱仪，PAD检测器，色谱柱:DiamonsilTMC18;X-1001型旋转蒸发器;SH2-III型循环水真空泵;Fuhe HH-4数显恒温水浴锅;

试剂:甲醇、乙腈均为色谱纯(Tedia，美国);石油醚(30～60℃)为分析纯(中国医药集团上海化学试剂有限公司);角鲨烯标准品(Sigma，美国)，纯度99%;

1.2 实验材料来源

糯米香茶原种采自云南景洪一农家茶园，种植在华中农业大学温室。取成熟叶片，阴干后用于提取角鲨烯。

1.3 色谱条件

C18色谱柱(200 ×4.6 mm，5 um)(迪马，美国)，流动相甲醇/乙腈体积比为60/40(v/v)，采用等度洗脱，流速为1.2 mL/min，检测波长设定为 210 nm［5-7］。

1.4 样品制备

采用索氏提取法提取糯米香茶角鲨烯:称取20.0020 g糯米香茶干燥粉末(40目)并用滤纸包裹装入索氏提取器中，控制水浴温度恒为60℃，加入500 mL含有0.5%BHT的石油醚(30～60℃)回流提取10 h后浸泡8 h，收集石油醚提取液并用旋转蒸发仪除去石油醚，得到深绿色脂溶物，用甲醇定容至 50 mL 容量瓶中［3，8-10］。

1.5 标准溶液的制备

精密称取角鲨烯标准品25.9 mg，用无水甲醇定容至25 mL容量瓶中，超声波辅助溶解，得到浓度为1.036 mg/mL的标准溶液，稀释 10倍得到0.1036 mg/L的标准溶液。

2 方法与结果

2.1 流动相的选择

角鲨烯为不饱和的烃类化合物，采用反相色谱检测提取液中角鲨烯含量，调整甲醇/乙腈的比例进行测试，得出在甲醇∶乙腈=60∶40(v/v)时有较好的分离效果，色谱图如图1所示。并设定检测波长为210 nm，总流速为1.2 mL/min，柱温控制在40℃。在此色谱条件下标准溶液和样品色谱得到充分分离，标品角鲨烯保留时间为18.970 min，样品中角鲨烯保留时间为18.989 min，两者保留时间基本一致［5-6，11-14］。

图1 标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of the standards

图2 样品色谱图Fig.2 Chromatogram of the sample

2.2 检测波长的确定

角鲨烯标准品(Rt=18.970 min)的紫外波长图谱显示角鲨烯最大吸收波长为203.6 nm，索氏提取法提取的糯米香茶中角鲨烯(Rt=18.989 min)的紫外波长图谱与标准品相符，最大吸收波长亦为203.6 nm。认为在该色谱条件下角鲨烯的最大吸收波长即为203.6 nm。如图3，4所示。

2.3 标准曲线绘制

准确吸取标准溶液，依次进样 4，8，12，16，20 uL，按2.3色谱条件测定峰面积，以峰面积对进样量进行回归分析，得角鲨烯的回归方程为 Y=344.04X – 21.677，R2=0.9999 ，结果表明角鲨烯在 0.4144 ～ 2.0720 ug 范围内线性关系良好［5，6］。

表1 标准曲线测定结果Table 1 The standard curve

2.4 进样精密度试验

以0.1036 mg/L的标准品溶液连续进样6次，每次进样体积为20 uL，按照2.3 HPLC色谱条件测定峰面积，结果如表2，相对标准偏差RSD=0.56%(n=6)。

表2 角鲨烯精密度试验结果Table 2 The result of accuracy test(n=6)

2.5 回收率试验

采用加样回收法，精确称量20.0000 g糯米香茶粉末，采用1.4索氏提取法提取样品溶液，精确量取3.0 mL的样品溶液三份至洁净的带塞试管中，分别加入 1.0、2.0、3.0 mL 浓度为 0.1036 mg/mL 的标准品溶液，超声助溶10 min，进行HPLC法定量分析，结果如表3所示。符合《中国药典》2005版第 I部 95% ～ 105% 的规定［7，15，16］。

表3 回收率试验结果Table 3 The result of recovery experiment

2.6 供试液稳定性试验

精密称取糯米香茶干燥粉末样品20.0000 g，按照1.4提取方法制成供试液，每隔40 min进样1次，按1.3 HPLC色谱条件测定峰面积并计算出角鲨烯含量，结果见表4。

经计算得到峰面积平均值为4049.527 v·s，RSD为 1.41%，符合《中国药典》2005年版 I部RSD＜2% 的要求，表明采用索氏提取法提取得到的供试液稳定性较好。

表4 供试液稳定性试验结果Table 4 The result of sample stability test

2.7 样品测定

精确吸取样品溶液4 uL进样，采用外标法计算样品中角鲨烯含量，计算得出20 g糯米香茶粉末中角鲨烯平均含量约为14.79 mg，即0.0739% 。

3 结论

建立测定糯米香茶中角鲨烯含量的高效液相色谱法，证实糯米香茶中含有丰富的生物活性物质角鲨烯，其含量约为72.71 mg/100 g糯米香茶干燥粉末。

实验确定高效液相色谱条件为:DiamonsilTM C18色谱柱，流动相为甲醇/乙腈=60/40，检测波长为203 nm，流速为1.2 mL/min，柱温40℃。在此条件下角鲨烯标准品及糯米香茶中角鲨烯分离效果均良好，HPLC测定方法经检验其线性关系、精密度、回收率、供试液稳定性等均符合分析要求。该方法适用于糯米香茶中角鲨烯含量的测定。

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