发酵豆粕提取物中染料木素的分离纯化及结构鉴定

杨学娟，陈 钧，陈 华，刘友彬，张春晓

江苏大学食品与生物工程学院，镇江 212013

低温豆粕是大豆经低温提取豆油后的一种副产品。含有丰富的蛋白质，是家禽饲养的主要蛋白来源。经发酵以后的豆粕，更易于消化，同时还含有许多生理活性物质，具有重要的功能，如抗氧化，降血压，降血糖，降血脂，抗癌等等［1-6］。

染料木素(Genistein)为异黄酮的一种，结构见图1。它具有弱雌激素活性、抗癌、预防心血管疾病等功能，此外，还具有抗氧化、抗衰老、抗真菌、抑制真菌活性及酪氨酸蛋白激酶活性的功能［7］。染料木素和其他异黄酮成分主要存在于大豆中，在大豆中的含量约为0.1% ～0.5%［8］。对异黄酮的分离纯化技术主要有反相高效液相色谱法经典柱色谱法、高速逆流色谱法、固相萃取、膜分离技术等［9］。其中，传统柱色谱法比起其他纯化技术，虽然存在不可逆吸附的问题，但其可操作性强，在天然产物的分离纯化中广泛应用。

本文利用纳豆芽孢杆菌发酵豆粕，将豆粕中的异黄酮从糖苷形式转化成苷元形式，再使用硅胶柱色谱结合重结晶技术对提取物进行分离和提纯，得到纯度高达98%的染料木素。

图1 染料木素结构式Fig.1 Structure of genistein

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

纳豆芽孢杆菌js-1，江苏大学药学院分离鉴定并保存。

1.1.2 低温豆粕

安阳漫天雪制造有限公司

1.1.3 仪器

超净工作台(苏州亿达净化有限公司)，高压蒸汽灭菌锅(北京金辉盛业科技有限公司)，恒温恒湿摇床(上海福玛实验设备有限公司)，旋转蒸发仪(R-200，Switzerland)，紫外可见分光光度计(UV-2102，上海尤尼柯仪器公司)，高效液相色谱仪(LC-20A-SPD，日本岛津)，质谱仪(Thermo LXQ，美国)，核磁共振光谱仪(AVANCEⅡ400 MHz，瑞士Bruker)，玻璃色谱柱(柱直径50 mm，有效长度450 mm)

1.1.4 试剂

乙醇，正丁醇，甲醇，二氯甲烷，乙酸，均购自国药集团化学试剂有限公司。

一方面,若A∈∪i∈IcsOi,则存在i∈I使得A∈csOi,于是A∈csX且A∩Oi≠Ø,故A∩(∪i∈IOi)≠Ø,从而A∈cs(∪i∈IOi);另一方面,若A∈cs(∪i∈IOi),则A∈csX且A∩(∪i∈IOi)≠Ø,于是存在i∈I使得A∩Oi≠Ø,即存在i∈I使得A∈csOi,于是A∈∪i∈IcsOi,从而cs(∪i∈IOi)=∪i∈IcsOi。

硅胶，青岛海洋化工厂。T-AOC试剂盒，南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 发酵豆粕提取物的制备

将豆粕(100 g)以最佳条件进行纳豆芽孢杆菌发酵，60℃干燥，以质量分数为60%的酒精提取，浓缩，真空冷冻干燥(冻干粉40 g)。

1.2.2 提取物的预处理

将提取物冻干粉用适量蒸馏水溶解，以水饱和的正丁醇进行萃取，萃余相浓缩，干燥后，再以甲醇提取，甲醇提取物浓缩，干燥即为过柱提取物(7.5 g)

1.2.3 硅胶柱层析

装柱:实验采用干法装柱。将硅胶直接填入柱之中，然后轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止。

上样:先用少量的甲醇溶解样品再和硅胶混匀，然后将混有样品的硅胶干燥，粉碎成细粉，均匀地铺在色谱柱的顶部。

洗脱:用二氯甲烷和甲醇混合液进行梯度洗脱(30∶1～0∶1)，收集不同的流分，以薄层层析进行跟踪，合并薄层行为一致的流分，各流分分别浓缩，干燥，测定抗氧化活性强弱，得抗氧化活性最强的流分Ⅱ(0.7 g)，继续硅胶柱层析得薄层层析单点的淡黄色粉末(50 mg)。

1.2.4 重结晶

将此淡黄色粉末以甲醇溶解进行重结晶得淡黄色晶体(37 mg)。

1.2.5 抗氧化能力测定

按照总抗氧化能力(T-AOC)试剂盒进行操作。

1.2.6 结构鉴定

取一部分重结晶的淡黄色晶体，以甲醇溶解，测定UV最大吸收光谱及HPLC;一部分送分析测试中心，检测1H NMR，13C NMR，以及 MS。

2 结果与讨论

2.1 UV 吸收光谱

从该物质的UV扫描光谱(见图2)可以确定该物质的最大吸收波长为260 nm，以此做为HPLC检测波长。

图2 染料木素的紫外吸收光谱Fig.2 UV absorption spectra of genistein obtained

2.2 HPLC 分析

以甲醇﹕水(50﹕50)为流动相;检测波长为260 nm的条件进行HPLC分析，结果表明纯度达到98%以上。

图3 染料木素的高效液相色谱Fig.3 HPLC of genistein obtained

2.3 质谱

由质谱可以确定活性物质的分子量为270。

图4 染料木素的质谱Fig.4 MS of genistein obtained

2.4 NMR

该提取物质的C谱、H谱见图5，图6，从图5可以看出该物质的核磁共振峰都处在较低场，说明化合物中的碳都以双键或芳环的形式存在。

13C NMR(MeOD)解析结果 δ:93.38(C-8)，98.72(C-6)，104.87(C-10)，114.85(C-3’，5’)，121.91(C-3)，123.32(C-1’)，129.97(C-2’，6’)，153.36(C-2)，157.41(C-9)，158.30(C-4)，162.44(C-5)，164.56(C-7)，180.83(C-4)。

1H NMR(MeOD)解析结果 δ:8.05(s，1H，C2-H)，7.39-7.37(d，2H，C2’，6’-H)，6.87-6.85(d，2 H，C3’，5’-H)，6.34(s，1H，C8-H)，6.23(s，1H，C6-H)，由于使用溶剂是氘代甲醇，所以苯环上的C5，7，4’-OH 未显示。

通过综合分析该物质的紫外吸收图、氢谱、碳谱和质谱，以及参考文献［10-13］可以确定该化合物是染料木素。

3 结论

本文用常规的硅胶柱色谱及重结晶技术，从发酵豆粕提取物中分离出染料木素，并经UV、MS、1H NMR、13C NMR等多种波谱学方法鉴定证实了其结构。高效液相色谱分析表明，所提纯的染料木素纯度达到了98%以上。从理论上，为发酵豆粕开发成保健食品奠定了基础。

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