中国东海与黄海海域海洋细菌种类与药物敏感性研究

蒋学兵，马 聪，陈昌国，成 海，李文静，王艳菊

中国东海与黄海海域海洋细菌种类与药物敏感性研究

蒋学兵，马 聪，陈昌国，成 海，李文静，王艳菊

目的 调研我国东海与黄海两大海域海洋细菌种类与分布，分析海洋细菌对抗菌药物的敏感性。方法 用无菌海水采样器采集海水进行海洋细菌增菌培养和细菌分离，挑选单个菌落，应用VITEK全自动微生物鉴定仪、API(analytic producls INC)微生物鉴定系统和BIOMIC Vision检测仪进行细菌鉴定和药敏实验，并对海水进行细菌计数。结果 东海海域:采集54份海水样本，分离出各种细菌23种68株，其中弧菌科36株(52.9%)、肠杆菌科21株(30.9%)、非发酵菌9株(13．2%)、屎肠球菌 1株(1.5%)、真菌 1株(1.5%)。药敏结果显示，在20多种抗菌药物中，弧菌科、肠杆菌科、非发酵菌普遍对亚胺培南、美洛培南、头孢吡肟、头孢他啶、左旋氧氟沙星呈高度敏感，敏感性在90%以上，为优选抗生素;而对磺胺甲口恶唑、哌拉西林、头孢呋辛敏感性较低(＜60%)，为慎用或禁用抗生素;其他抗生素的敏感性为60%～90%，可作为备用抗生素。黄海海域:144份海水样本分离出各种细菌24种190株，其中非发酵菌82株(43.2%)、弧菌科78株(41.1%)、肠杆菌科23株(12.1%)、肠球菌5株(2.6%)，真菌2株(1.0%);药敏结果显示，在20多种抗菌药物中，弧菌科、肠杆菌科、非发酵菌普遍对亚胺培南、美洛培南、头孢吡肟、头孢他啶、左旋氧氟沙星呈高度敏感性(＞90%)，为优选抗生素;而对哌拉西林、磺胺甲口恶唑、头孢呋辛敏感性较低(＜60%)，为慎用或禁用抗生素;其他抗生素的敏感性为60%～90%，可作为备用抗生素。在东海海域中分离出热带念株菌，在黄海分离出深红酵母菌和类星形假丝酵母菌。结论 本项调查建立了东海和黄海两大海域海洋细菌菌谱及药物敏感性的本底数据库，为海上作业伤、海上意外伤等海洋细菌感染早期防治研究与抗菌药物的选用提供了理论依据。

海洋细菌;细菌种类;细菌鉴定;药物敏感性试验

目前，各国都将海洋资源视为战略资源，随着海洋资源的开发，海上运输、作业日趋频繁，为了解我国东海与黄海两海域海洋细菌种类与分布特点，分析海洋细菌对常用抗菌药物的敏感性，为海上作业伤和海上意外伤合并海水浸泡时海洋细菌早期感染抗生素的选用提供参考，我们于2006－2007年对东海与黄海海域进行了细菌学调查，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 增菌培养基 碱性蛋白胨水、嗜盐菌增菌液、2号营养肉汤 、缓冲蛋白胨水、液体沙氏增菌液、支原体肉汤增菌液、金黄色葡萄球菌增菌液(均为英国OXOID产品)，按说明书配制增菌液;厌氧培养瓶(北京伯泰技术开发中心)。

1.1.2 分离培养基、诊断血清 硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐蔗糖琼脂培养基(thiosulfate citrate bile salts sucrose agar culture medium，TCBS)平板、血平板、中国蓝平板、沙门志贺菌属琼脂(Salmonella Shigella agar，SS)平板、木糖赖氨酸去氧胆酸盐琼脂(xylose lysine desoxycholate agar，XLD)平板、沙氏平板、酵母菌显色平板、蜡样芽孢平板、支原体琼脂平板、Mueller-Hinton(MH)琼脂平板、金葡分离平板与厌氧血平板(中国药品生物制品检定所或天津市金章科技发展有限公司);霍乱菌与志贺菌诊断血清(兰州生物制品研究所)。

1.1.3 仪器 VITEK-AMS微生物全自动分析仪、API(analytic producls INC)微生物鉴定系统、革兰阴性鉴定卡(gram-negative identification card，GNI)、革兰阳性鉴定卡(gram positive identification card，GPI)和酵母菌鉴定卡(yeast identification card，YBC)，法国生物梅里埃公司;BIOMIC Vision检测仪(Vastec公司，美国)。

1.2 海水采集方法 用无菌海水采样器随舰船航行时采集海水，采集点距岸边东海为50 m～30 km、黄海为50 m～50 km;约每10 km采样1次;水面下50～100 cm处取海水500 ml，每个点取2份，每份500 ml。东海海域共采集27个点54份海水样本，黄海海域共采集72个点144份海水样本。

1.3 细菌培养 立刻用无菌注射器取采样器深部海水10 ml打入厌氧增菌瓶，然后分别在含有10 ml支原体肉汤增菌液、5 ml碱性蛋白胨水、5 ml嗜盐菌增菌液、5 ml缓冲蛋白胨水、5 ml 2号营养肉汤、5 ml液体沙氏增菌液、5 ml金黄色葡萄球菌增菌液的瓶中加入45 ml海水(均为无菌操作)，35℃环境下增菌培养。碱性蛋白胨水与嗜盐菌增菌液对海水细菌增菌培养6～12 h，厌氧菌培养瓶35℃增菌24～48 h，支原体肉汤35℃增菌48～72 h，液体沙氏增菌液35℃增菌24～48 h，其他增菌液增菌培养18～24 h，然后进行细菌分传培养。

1.4 增菌培养后分传培养 碱性蛋白胨水与嗜盐菌增菌液分传TCBS平板与血平板，35℃孵育18～24 h。2号营养肉汤分传血平板、中国蓝平板、蜡样芽孢平板、沙氏平板与XLD平板，35℃孵育18～24 h。缓冲蛋白胨水分传XLD、SS平板与中国蓝平板，35℃孵育18～24 h。厌氧菌肉汤分传血平板与厌氧血平板，血平板放35℃培养18～24 h，厌氧血平板放厌氧罐35℃培养24～48 h。液体沙氏增菌液分传沙氏与酵母菌显色平板，35℃孵育24～72 h，如未见真菌生长放至168 h。支原体肉汤增菌液分传支原体琼脂平板，35℃孵育120～240 h。金葡菌增菌液分传金葡分离平板，35℃孵育24～48 h。

1.5 鉴定方法 海洋细菌应用VITEK-AMS微生物全自动分析仪、GNI、GPI和YBC鉴定卡进行细菌鉴定，应用API系统与BIOMIC Vision检测仪对API反应板进行扫描读码确认鉴定，应用BIOMIC Vision检测仪对MH琼脂药敏平板进行海洋细菌的药物敏感性检测。

1.6 海水细菌菌落计数 每个采集点用10 μl无菌定量接种环取海水涂布于血平板2份，置35℃温箱中培养24～72 h后进行细菌菌落计数，计算均值。

2 结果

2.1 海水样本采集时海洋环境因素及海水的理化指标 见表1。

表1 海水采集时海洋环境因素及海水的理化指标

2.2 海洋浅表层细菌菌落 东海、黄海海水细菌菌落平均分别为2 752 cfu/ml、1 986 cfu/ml，且两海域海水细菌菌落均随离陆地距离的增加呈梯度下降的现象(表2)。

表2 采样点离陆地远近与海水细菌菌落

2.3 海洋细菌检测 东海海水样本中分离出各种海洋细菌68株，黄海海水样本中分离出各种细菌190株(表3)。

表3 东海与黄海海水样本各类细菌检出情况［株(%)］

2.4 东海与黄海海域海洋细菌种类检出情况 见表4。

表4 东海与黄海海洋细菌检出情况

2.5 东海与黄海海域海洋细菌对抗菌药物的敏感性 见表5。

表5 东海与黄海海洋细菌对抗菌药物的敏感性

3 讨论

海洋资源作为一种战略资源越来越受到各国的重视，随着海上作业活动日益增多，海上作业伤和意外伤合并海水浸泡而致的海洋细菌感染问题越来越受到医学界的关注。海洋细菌学的研究国外已有较多报道［1-3］，我国微生物工作者对沿海部分口岸海水细菌致病性的研究也有陆续报道［4-12，17-18］。对东海和黄海海域海洋细菌种类与药物敏感性的大范围调研工作，此前鲜见报道。

调查结果显示:在东海海域分离出的68株细菌中弧菌占52．9%，其次是肠杆菌科细菌30.9%和非发酵菌13.2%;在黄海海域分离出的190株细菌中，非发酵菌占43.2%，弧菌占41.1%，肠杆菌占12.1%。弧菌是海水中的优势菌，东海肠杆菌科细菌的比例明显高于黄海，黄海非发酵菌的比例则明显高于东海，两海域在细菌种类构成方面存在不同，是否与海水的理化因素及气候因素相关，还需要进一步的研究。分析发现近海海水中肠杆菌和非发酵菌的检出率高于远海，而弧菌的检出率则相反;东海海水细菌菌落平均为2 752 cfu/ml，黄海细菌菌落平均为1 986 cfu/ml，高于赖福才［4］的报道，并随离陆地距离的增加海水细菌菌菌落呈梯度下降的现象。笔者认为上述现象与近海离陆地近，受陆地细菌的影响有关。

在致病性弧菌中，创伤弧菌引起的疾病最为严重，创伤弧菌感染的伤口如得不到及时控制，引起的菌血症和伤口感染的病程进展非常快甚至死亡［13-16］。东海与黄海海域均检出创伤弧菌，应引起人们的关注。值得注意的是在本次调研中，东海分离出热带念珠菌，黄海分离出深红酵母菌和类星形假丝酵母菌，与赖福才［4］和韩善桥［9］报道不同。本次调研未在海水中分离出金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、专性厌氧菌和支原体，也未检出致病性霍乱弧菌、沙门菌和志贺菌。

药敏结果显示，在20多种抗菌药物中，海水里的弧菌科、非发酵菌和肠杆菌科普遍对亚胺培南、美洛培南、头孢吡肟、头孢他啶、左旋氧氟沙星高度敏感，敏感率在90%以上，这几种抗菌药物在海上作业伤和海上意外伤合并海水浸泡的早期救治中应是首选药物;对磺胺甲口恶唑、哌拉西林、头孢呋辛的敏感性较低，为慎用或禁用抗生素;其余抗菌药物可作为备选药物。

此次海水细菌学调研摸清了东海与黄海海域海洋细菌的种类、分布和两海域细菌对目前常用抗菌药物的敏感性情况，为未来可能发生的海上作业伤、海上意外伤合并海水浸泡条件下的早期感染抗菌药物的选用提供了理论依据。

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Studies on the species and antimicrobial susceptibility of marine bacteria in the East Sea and the Yellow Sea of China

JIANG Xue-bing1，MA Cong2，CHEN Chang-guo2，CHENG Hai1，LI Wen-jing1，WANG Yan-ju1
(1.Department of Blood Transfusion，Navy General Hospital，Beijing 100048，China;2.Department of Clinical Laboratory，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

Objective To investigate the species and antimicrobial susceptibility of marine bacteria isolated in the East Sea and the Yellow Sea of China．Methods The seawater samples were taken by sterile sampling instrument，and then enriched，cultured and isolated．Drug sensitivity tested by VITEK-AMS，API system and BIOMIC Vision surveymeter．Results In the East Sea area，a total of 23 kinds，68 marine bacteria were isolated from 54 seawater samples，including 36 vibrios(52.9%)，21 enterobacteria(30.9%)，9 nonfermenters(13.2%)，1 Enterococcus feacium(1.5%)and 1 fungus(1.5%)．Of the more than 20 kinds of antibiotics，the vibrios，enterobacteria and nonfermenters were generally susceptive(＞90%)to Imipenem，Meropenem，Cefepime，Ceftazidime and Levofloxacin，so as those were recommended as first-choice antibiotics．However，the marine bacteria were less sensitivity(＜ 60%)to Piperacillin，Sulfamethoxazole and Cefuroxime，which should be prohibited or used with prudence．The rest of antibiotics，with the sensitivity rate range from 60%to 90%，were recommended as alternate antibiotics．In the Yellow sea area，a total of 24 kinds，190 marine bacteria were isolated from 144 seawater samples，including 82 nonfer-menters(43.2%)，78 vibrios(41.1%)，23 enterobacteria(12.1%)，5 enterococcus(2.6%)and 2 fungi(1.0%)．Of the more than 20 kinds of antibiotics，the vibrios enterobacteria and nonfermenters were generally sensitive(＞90%)to Imipenem，Meropenem，Cefepime，Ceftazidime，Levofloxacin，so as those were recommended as first-choice antibiotics．However，the marine bacteria were less sensitivity(＜60%)to Piperacillin，Sulfamethoxazole and Cefuroxime，which should be prohibited or used with prudence．The rest of antibiotics，with the sensitivity rate range from 60%to 90%，were recommended as alternative antibiotics．The Candida tropicalis was isdated from the East sea，the Rhodotorula rubra andCandida stellatiodea were from the Yellow Sea．Conclusion This investigation provides important data for the establishment of the bacterial spectrum database and sensitivity of the East Sea and the Yellow Sea of China，which supplys a theoretical basis for early-stage infection caused by offshore operation，accidental wound-prevention and the optimizing antibiotic treatment．

Marine bacteria;Species;Identification;Antimicrobial susceptibility test

R378

A

2095-3097(2012)02-0100-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2012.02.009

2012-07-02 本文编辑:张在文)

全军医药卫生指令性课题(05Z018)

100048北京，海军总医院输血科(蒋学兵，成 海，李文静，王艳菊)，检验科(马 聪，陈昌国)

马 聪，E-mail:macong958166@163.com